增鮮劑5’-肌苷酸二鈉惡化老齡db/db小鼠 脂質代謝紊亂的分子機制

姜允嘉，劉金艷，許賽君，王 洋，張 彬，成 鐘，許 揚，謝 勇*

（中國醫學科學院/北京協和醫學院藥用植物研究所，中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室，北京 100193）

5’-肌苷酸（inosine 5’-monphosphate，IMP）是讓人體感知鮮味特性的主要物質之一，具有呈味作用穩定持久的優點，容易分離提取，pH 7.5環境結晶的IMP為二鈉鹽。GB 2760—1996《食品添加劑使用衛生標準》規定，IMP二鈉鹽可在各類食品中按生產需要適量使用。添加5%～12% IMP二鈉鹽并與谷氨酸鈉混合使用，其呈味作用較單獨使用谷氨酸鈉高約8 倍，IMP二鈉鹽有“強力味精”之稱，是日常生活中所用豆瓣醬、醬油、雞精等調味品的主要成分之一。在生物體內，IMP是嘌呤核苷酸從頭合成途徑中最先合成的化合物，是合成腺苷酸基琥珀酸（S-AMP）、鳥苷酸等的前體[1]， 這些化合物具有調節細胞代謝、能量遷移、增殖、死亡和DNA、RNA合成等功能[2]。S-AMP是嘌呤核苷酸從頭合成途徑中IMP的下一個產物，也是一種天然胰島素分泌促進劑[3]。王楠等[4]基于酶促動力學，以IMP為原料實現了S-AMP大量合成；王洋等[5]研究發現S-AMP和一磷酸腺苷（adenosine 5’-monophosphate，AMP）活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）形成復合體后促進AMPK活化，降低飲食誘導的高血脂癥小鼠肝內脂質蓄積和血脂濃度，可作為治療非酒精性脂肪肝的先導化合物開展成藥性研究。IMP和S-AMP均為AMP的分子結構類似物，由此推測IMP可能也具有活化AMPK提高糖脂代謝效率而改善糖脂代謝紊亂疾病的功能，且IMP與AMP的分子結構相似度高于S-AMP，因此，IMP可能較S-AMP更具有藥物或功能性食品的開發前景。然而，目前鮮有相關研究成果報道。C57/KsJ-db/db（簡稱db/db）小鼠是一種長期罹患嚴重糖尿病和高血脂癥的模式動物。為深入了解IMP活化AMPK后引起小鼠等模式動物的代謝變化規律并探討IMP是否具有保健功能或食品安全隱患，本研究對6 月齡自發性糖尿病db/db小鼠灌胃IMP 8 周，分析小鼠生理學指標變化和作用機制，為全面理解IMP等嘌呤核苷酸的生物學功能提供基礎生物學領域研究證據。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

HepG2細胞由國家實驗細胞資源共享服務平臺提供；大腸桿菌質粒pET-21a由本實驗室保存。

SPF級db/db小鼠和C57/BL/6j（簡稱C57）小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司（生產許可證號：SCΧK（京）2019-0001），在中國醫學科學院藥用植物研究所SPF動物房內按照實驗動物飼養規程飼養和給藥（使用許可證號：SYXK（京）2017-0020，有效期2017年 6月16日至2022年6月16日）。

IMP（食品級） 希杰（聊城）生物技術有限公司；尿酸（uric acid，UA）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒 美國Abcam公司；乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、磷酸化ACC1（phospho-ACC1，p-ACC1）、p-ACC2、甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）、AMPK、p-AMPK等一抗 美國Cell-Signal Technology公司；二抗辣根過氧化物酶-山羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）、 青霉素-鏈霉素 北京博奧龍免疫技術有限公司；蛋白質電泳分離膠（聚丙烯酰胺質量分數4%～12%遞增） 南京金瑞斯生物科技有限公司；PrimeScrip RT MasterMix反轉錄試劑盒、SYBR Premix ExTaq實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒 日本Takara公司；DMEM低糖培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶（25 g胰蛋白酶溶于0.975 L的PBS） 美國HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibio Life Technologies公司；油酸、洛伐他汀等試劑 美國Sigma-Aldrich公司；bodipy 493/503中性脂質染色劑 美國Thermo Fisher公司；乙酰輔酶A含量測定試劑盒 上海索橋生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）紅色熒光染料MitoSOΧ Red 美國Molecular Probes公司；血糖儀及配套血糖試紙 美國Roche公司。

1.2 儀器與設備

FortéBio型表面等離子共振（surface plasma resonance，SPR）儀 美國Pioneer公司；AU480型全自動生化儀 美國Beckman公司；M1000型多功能連續 波長分光光度計 瑞士Tecan公司；IΧ51型熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；LightCycler? 96 SW 1.1型qPCR儀 美國Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗小鼠的藥物處理及分組

稱取一定量IMP，配制為pH 7.5的飽和水溶液，置于4 ℃冰箱內12 h重結晶，回收晶體，于70 ℃恒溫箱中干燥48 h，準確稱量，配制成50 mg/mL水溶液。

挑選6 月齡、空腹血糖濃度約15 mmol/L、體質量52～64 g的雄性db/db小鼠，分為兩組，每組10 只。設定未給藥小鼠為模型組，另一組為給藥組，按劑量 50 mg/（kgmb·d）灌胃IMP溶液，連續給藥8 周。以月齡相同的雄性C57小鼠5 只作為正常對照組，全部小鼠均使用正常飼料喂養。給藥開始后每隔7 d用電子天平稱量小鼠體質量，并測定小鼠空腹血糖濃度，每次測定前小鼠禁食12 h，剪尾法取血，將血糖試紙安裝在血糖儀中，添加約20 μL血液到血糖試紙的進樣口內，記錄血糖儀上顯示的血糖濃度。

1.3.2 小鼠生理學指標測定

給藥8 周后，小鼠禁食16 h后進行取樣。收集小鼠尿液，按照UA檢測試劑盒說明書步驟測定UA濃度。采集小鼠血清，用相應檢測試劑盒分別測定血清ALP、AST、ALT、LDH活力；用全自動生化儀測定血清甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）濃度。

采集血樣后立即處死小鼠，取心臟、肝臟和腎臟，收集的小鼠器官用10%福爾馬林溶液固定后石蠟包埋，切片。肝組織切片用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后用油紅O復染，心肌切片分別用天狼猩紅和油紅O染色，腎臟組織切片分別用HE染色和過碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色后用顯微鏡觀察并拍照保存。剩余小鼠器官樣品于-80 ℃冰箱中凍存。

1.3.3 IMP與AMPKγ1亞基的分子互作分析

根據文獻[6]報道的蛋白質表達和純化方法利用大腸桿菌質粒pET-21a表達人源AMPKγ1亞基（NCBI參考序號：NP_002724.1）。室溫下利用SPR儀按照王洋等[5]的方法進行IMP和AMPKγ1亞基相互作用分析。用分子對接方法預測IMP-AMPKγ1亞基復合體的三維結構，以AMPK-AMP復合體結構（PDB登錄號：4EAI）[6]為受體分子，利用Pymol軟件（http://www.pymol.org）確定AMPK結合部位中與小分子形成氫鍵的氨基酸。分別將AMPK結構和小分子IMP導入Autodock分子對接軟件中，利用Autodock Tools計算Gasteiger電荷，添加原子類型得到其坐標文件，對配體小分子IMP加極性氫、計算電荷、確定扭矩中心、選擇可旋轉的鍵得到其坐標文件。設定對接的格點參數文件，格點間距設置為0.375 ?，結合空間大小為40 ?×40 ?×40 ?，以保證配體完全處在酶活性中心范圍內，然后設定對接參數文件，利用半柔性對接方法進行分子動力學穩定性計算，使用拉馬克遺傳算法，算法對接輪數設置為50，其他參數取默認值，利用Autodock 4軟件計算出IMP-AMPK復合體的空間結構。

1.3.4 肝臟蛋白免疫印跡分析

小鼠肝組織加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，用手術剪盡量剪碎后用超聲波破碎細胞，離心取上清，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品。按照Wu Chongming等[7]所述條件進行蛋白免疫印跡分析。

1.3.5 qPCR分析脂質代謝通路中蛋白mRNA相對表達量

提取各組小鼠肝組織的總RNA并測定其濃度，隨即使用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA文庫。采用qPCR法測定脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）、肉毒堿棕櫚?；D移酶1A（carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A）、固醇酰輔酶A脫氫酶1（stearyl coenzyme A dehydrogenase 1，SCD1）的mRNA相對表達量。反應體系：SYBR Premix ExTaqqPCR試劑盒中的Supermix試劑6.25 μL，正向引物、反向引物溶液（10 μmol/L）各0.25 μL，cDNA 200 ng，添加ddH2O至總體積12.5 μL。反應條件：95 ℃變性10 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸30 s，擴增40 個循環。選擇18S rRNA為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。擴增基因引物由上海捷瑞生物技術公司合成，引物序列如表1所示。

表1 IMP與AMPKγ1亞基相互作用參數Table 1 Parameters of interaction between IMP and AMPKγ1 subunit

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time polymerase chain reaction used in this study

1.3.6 IMP的體外降脂活性實驗

5% CO2的細胞培養箱中用含有1%青霉素-鏈霉素和10% FBS的DMEM低糖培養基于37 ℃培養HepG2細胞，鋪96 孔板，細胞數約為1×104個/孔，分為對照組、模型組、陽性對照組和給藥組。IMP、洛伐他汀和油酸溶液均用上述培養HepG2細胞的培養基溶液配制。以100 μmol/L油酸100 μL誘導形成脂質蓄積細胞，作為模型組。油酸造模同時給藥，加入100 μL的10 μmol/L IMP為給藥組，以加入100 μL的10 μmol/L洛伐他汀為陽性對照組，于含有5% CO2的細胞培養箱中37 ℃培養24 h后用100 μL的4%多聚甲醛固定細胞，加入100 μL 2 μmol/L bodipy 493/503染色，用熒光倒置顯微鏡觀察并記錄細胞內脂質蓄積情況。

HepG2細胞按上述方法分組并給藥處理后，棄去培養基，每孔加入含5 μmol/L MitoSOΧ Red的DMEM基礎培養基，細胞培養箱內37 ℃避光培養30 min，用PBS清洗3 次，再加入DMEM基礎培養基，用熒光倒置顯微鏡觀察細胞ROS蓄積情況。

1.3.7 乙酰輔酶A含量測定

準確稱取小鼠心、肝組織，按照0.1 g組織加入1 mL RIPA裂解液，于冰浴下勻漿破碎細胞，4 ℃、16 000×g離心20 min，取上清液，待測。按照試劑盒所述方法配制工作液，取工作液92 μL和樣品溶液10 μL混勻后開始計時，于混勻后20 s和80 s時測定反應體系340 nm波長處吸光度。乙酰輔酶A的總量按如下公式計算。

式中：A1、A2分別為混勻后20 s和80 s時反應體系340 nm波長處吸光度；m為組織樣品質量/mg。

1.4 數據處理與分析

使用GraphPad Prism 5.0軟件進行數據統計分析，結果以平均值±標準差表示，采用單因素方差分析、Tukey’s檢驗或Newman-Kueuls檢驗分析組間差異，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 IMP處理db/db小鼠的生理學指標

由圖1可知，給藥期間模型組db/db小鼠體質量高度顯著高于正常對照組C57小鼠（P＜0.001），且各組小鼠體質量均無明顯變化（圖1A）。給藥前模型組db/db小鼠空腹血糖濃度（＞15 mmol/L）約為C57小鼠的3 倍，表明其患有嚴重的糖尿病，IMP給藥期間給藥組小鼠空腹血糖濃度較模型組小鼠顯著降低（P＜0.05），但依然為高血糖水平（＞10 mmol/L），可以認為IMP降糖活性較弱（圖1B）。給藥結束后，正常對照組小鼠尿液中UA濃度最高，模型組小鼠次之，IMP給藥后db/db小鼠尿液UA濃度最低，但與模型組差異性不顯著（圖1C）。與模型組相比，給藥組小鼠血清TC濃度顯著升高（P＜0.05），HDL濃度極顯著升高（P＜0.01），TG和LDL濃度雖有所升高，但兩組間差異不顯著（圖1D）。由圖1E～H可知，與模型組相比，給藥組小鼠ALP、AST、ALT和LDH活力均顯著上升（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）。AST/ALT活力比值大于1，表明肝臟受到實質損害[8]，ALP、LDH活力顯著升高，表明發生了肝硬化[9]。

圖1 IMP給藥結束后各組小鼠的生理學指標Fig.1 Physiological indicators of mice in each group after IMP administration

Manne等[10]通過觀察小鼠肝組織形態發現，即使是C57小鼠，隨著年齡增長肝組織也會出現脂質蓄積，可能患有輕度非酒精性脂肪肝。由圖2可知，本實驗中，與正常對照組C57小鼠相比，模型組db/db小鼠肝組織中呈現大量脂肪顆粒，表明微泡脂肪變性并發脂質蓄積，脂肪肝程度明顯加重，而給藥組小鼠肝組織脂肪顆粒較模型組更多，此現象和小鼠血清脂質含量的變化趨勢 （圖1D）一致，表明IMP給藥后反而加重了db/db小鼠肝臟內脂質蓄積。對比各組小鼠心肌組織形態，天狼猩紅染色結果表明IMP未對心肌造成明顯損傷，油紅O染色結果表明模型組和給藥組小鼠心肌組織內脂質蓄積較正常對照組嚴重，IMP給藥后沒有發生明顯變化。腎臟組織HE染色結果表明，各組小鼠腎臟組織沒有發生明顯改變，而PAS染色結果顯示，IMP給藥后db/db小鼠腎小球內有糖含量降低的現象，這與IMP有一定降糖效果一致。這些結果證明，IMP給藥后反而加重了db/db小鼠脂質代謝紊亂癥狀，并造成了更嚴重的肝損傷，但對心臟和腎臟沒有造成損傷，血糖與UA濃度的降低表明對腎臟有保護作用[11]。以上研究結果顯示IMP損傷的靶器官為肝臟。

圖2 IMP給藥后各組小鼠肝臟、心臟和腎臟組織形態Fig.2 Histological morphology of liver, heart, and kidney in each group of mice after IMP administration

2.2 IMP-AMPK相互作用結果

SPR分析可顯示小分子和靶標蛋白相互作用過程中靶蛋白分子質量隨時間的變化，響應值的變化趨勢可直觀顯示分子間結合和解離[7]。如圖3A所示，IMP和AMPKγ1亞基瞬間結合，在SPR整個測試周期（300 s）內沒有顯示解離，這與S-AMP與AMPKγ1亞基相互作用時產生的SPR信號相似，但與AMP和AMPKγ1亞基相互作用產生的SPR信號[5]不同。由 表1可知，AMP與AMPKγ1亞基形成復合體的KD值為 （174±3）μmol/L，S-AMP與AMPKγ1亞基形成復合體的KD值為（12.0±0.2）μmol/L[5]，而IMP-AMPKγ1亞基復合體KD值為（211±4）μmol/L，明顯高于AMP和S-AMP，但IMP與AMPKγ1亞基結合后形成的復合體穩定性仍較弱，但由于AMPKγ1亞基具有4 個結合位點[12]， 每個位點都能與IMP實現瞬間結合和解離，因此宏觀來看，IMP和AMPKγ1亞基在一定時間內能夠形成穩定復合體，因此監測到的響應值與IMP濃度呈正相關。此外，分子對接計算結果顯示IMP結合在AMPKγ1亞基中AMP結合位點時的最佳結合能為-28.368 kJ/mol，得到的 IMP-AMPKγ1亞基復合體結構中IMP的構型與AMP-AMPKγ1復合體結構中AMP構型相同，且可能形成更多氫鍵 （圖3B），這些結果證明IMP和AMPK可以形成復合體。

圖3 IMP和AMPK的分子互作結果Fig.3 IMP interacted with AMPK

2.3 脂質代謝通路中蛋白相對表達量

人體細胞內AMPK是糖脂代謝通路中的關鍵蛋白，AMP或AMP結構類似物與AMPKγ亞基結合后，其α亞基Thr172位點被磷酸化，磷酸化的AMPK誘導活化糖、脂質等代謝通路，AMPK的磷酸化水平反映了其活性的高低[13]。由圖4A～C可知，與模型組相比，IMP和AMPKγ亞基形成復合體可提高db/db小鼠肝臟細胞內AMPK磷酸化水平，給藥組小鼠在AMPK活化的下游脂質代謝通路中ATGL相對表達量與模型組相比也無顯著變化，表明肝臟細胞內蓄積脂肪的分解沒有被促進[14]，因此IMP不能促進脂肪分解為脂肪酸。ACC包含ACC1和ACC2兩種亞型[15]， ACC1分布于胞質中，可催化長鏈脂肪酸的合成[16]，ACC2分布于線粒體膜上，其磷酸化水平上升表明細胞內脂肪酸氧化被促進[17]。與模型組相比，IMP使小鼠肝臟總ACC表達量極顯著升高（P＜0.01），ACC1和ACC2的磷酸化水平提高，由此可見，IMP和AMPK形成復合體后顯著提高小鼠肝臟內脂肪酸氧化。

圖4 各組小鼠肝臟內脂肪分解相關蛋白相對表達量Fig.4 Relative expression levels of proteins related to lipolysis in mice

FASN、LPL、CPT1A和SCD1是脂質代謝通路中的限速酶[18]。由圖4D～G可知，與模型組相比，IMP可顯著提高db/db小鼠CPT1A和SCD1mRNA表達量 （P＜0.05），CPT1A催化長鏈脂肪酸由胞漿轉移到線粒體氧化[19]，SCD1催化飽和脂肪酸轉化為不飽和脂肪酸，促進脂肪酸分解[20]，這兩種基因表達水平的增加表明IMP促進了線粒體內脂肪酸氧化。與正常對照組相比，模型組小鼠FASN和LPLmRNA表達量均顯著升高（P＜0.05），IMP給藥后db/db小鼠FASN和LPLmRNA表達量較模型組降低，但組間無顯著性差異。FASN催化乙酰輔酶A從頭合成棕櫚酸酯的全過程，是造成脂質蓄積的重要蛋 白質[21]，LPL催化TG水解[22]，二者mRNA表達量降低表明肝內脂肪蓄積和分解被干擾，發生了更嚴重的脂質代謝紊亂，這與IMP給藥后db/db血清中HDL和LDL濃度均高于模型組的結果一致。

2.4 IMP對脂質蓄積HepG2細胞的降脂活性

通過熒光顯微鏡可以觀察10 μmol/L IMP和10 μmol/L 洛伐他汀給藥24 h后各組HepG2細胞內的脂質和ROS蓄積情況。由圖5可知，bodipy 493/503染色結果表明，IMP組細胞內脂質蓄積量明顯低于相同濃度的洛伐他汀。IMP能加速脂肪酸氧化，導致HepG2細胞內脂肪加速分解為甘油和脂肪酸，脂肪酸用于滿足氧化代謝需求，因而體外細胞實驗觀察到IMP的降脂活性明顯高于洛伐他汀。MitoSOΧ Red染色結果顯示，對照組和模型組細胞紅色熒光無明顯差異，洛伐他汀作用后依稀可見微弱的紅色熒光，而IMP組可見明顯的紅色熒光，表明IMP增加了肝細胞ROS的生成。ROS產生的主要部位是線粒體[23]，由于IMP促進脂肪酸加速氧化，細胞在應激條件下產生過多的ROS以完成相應氧化反應，還原型輔酶II氧化酶和過氧化物酶被活化，進一步增加了肝細胞的氧化應激[24]，線粒體穩態降低并導致DNA損傷[25]，從而導致小鼠肝損傷。

圖5 IMP對HepG2細胞內脂質和ROS蓄積的影響Fig.5 Fluorescence micrographs describing lipid and ROS accumulation in HepG2 cells treated by IMP

2.5 小鼠肝臟和心臟乙酰輔酶A含量

如圖6所示，正常對照組C57小鼠肝臟和心臟組織中乙酰輔酶A含量分別約為3 nmol/mg和6 nmol/mg，而模型組db/db小鼠肝臟和心臟內乙酰輔酶A含量急劇降低，為無檢出狀態；與正常對照組相比，IMP處理后db/db小鼠肝臟乙酰輔酶A含量高度顯著升高（P＜0.001），約為其6 倍，心臟乙酰輔酶A含量較模型組明顯升高，但低于正常對照組，約為其50%。乙酰輔酶A是動物體內一種重要的代謝中間產物[26]。蛋白質、糖、脂肪三大營養物質分解代謝都會生成乙酰輔酶A，乙酰輔酶A除進入三羧酸循環最終代謝為CO2和H2O之外[27]，也是肝臟內合成新的 脂肪、膽固醇和酮體的原料[28]。由于脂肪酸氧化分解的主要途徑是β-氧化，而β-氧化會產生乙酰輔酶A[29]，當長期罹患代謝綜合征小鼠肝臟內三羧酸循環不足以消耗脂肪酸過度氧化產生乙酰輔酶A時，過剩的乙酰輔酶A被合成為TC和TG，表明小鼠脂代謝紊亂癥狀加劇惡化，同時引發血清HDL和LDL濃度升高，表明這種模式動物肝臟內的三羧酸循環效益顯著低下。此外，心臟自動收縮的過程需要消耗大量能量，心肌細胞的三羧酸循環活性高于肝細胞，相對而言，心肌細胞內IMP刺激產生的過剩乙酰輔酶A容易被徹底代謝為H2O和CO2，為心臟自主運動供給能量，不易發生氧化應激損傷，因此未觀察到小鼠心臟損傷。

圖6 給藥結束后各組小鼠的肝臟和心臟內乙酰輔酶A含量Fig.6 Acetyl-CoA contents in liver and heart of mice in each group after IMP administration

3 討 論

AMPK是調控脂質代謝的一種關鍵蛋白，能與其形成復合體提高其磷酸化水平的化合物都潛在具有提高脂質代謝效益的功能，前期研究已發現S-AMP具有這一功能[5]，提示IMP可能也具有這樣的功能。IMP作為廣泛使用的食品添加劑，毒理學研究證明IMP滿足食品安全要求[30]，因此，本研究探索其作為新藥或保健食品的可行性。一般認為AMPK的激動劑能促進脂質代謝，降低受試動物血清TG等水平，抵抗肝臟脂肪蓄積[2,5-6]，但本實驗結果表明IMP長期作用于老齡db/db小鼠后，小鼠脂質代謝紊亂癥狀更加惡化，血清TC濃度較模型組顯著升高（P＜0.05），可引發血管硬化，同時通過體外細胞實驗還觀察到IMP促進HepG2細胞內ROS產生。原因可能是老齡db/db小鼠體內，尤其是骨骼肌內三羧酸循環活性低下，IMP促進脂肪酸氧化生成的乙酰輔酶A不能被徹底代謝為CO2和H2O，導致肝臟內乙酰輔酶A含量較高。為抵抗乙酰輔酶A蓄積，肝臟產生氧化應激，產生大量ROS以氧化分解乙酰輔酶A，造成了肝氧化應激損傷；另一方面，乙酰輔酶A是合成TC、TG的原料，可導致體內TC、TG過量合成，因而導致老齡db/db小鼠體內脂質代謝紊亂更加惡化。因此可推測，用IMP治療飲食誘導產生高血脂癥的青壯年小鼠，小鼠的高血脂癥可能得到改善，與S-AMP給藥后的效果[5]相似。今后應開展不同生長周期的高血脂癥模型動物體內乙酰輔酶A代謝機制研究，從中發現非酒精性脂肪肝發病的新機制，并確定新的藥物作用靶標，為篩選治療非酒精性脂肪肝的新藥奠定基礎。在實現AMPK活化的同時促進乙酰輔酶A代謝，可能是研發治療非酒精性脂肪肝等脂質代謝紊亂疾病藥物的新思路。

鑒于高齡db/db小鼠代謝綜合征的發生發展機制和長期罹患糖尿病、高血脂癥等代謝綜合征的老年人相似，飲食中過多攝入IMP可能加重病情，由此建議對于患有代謝綜合征的老年人群應減少從食物中過度攝取IMP，同時盡快研究建立IMP的食品安全新標準，規定IMP食用范圍。加強運動能提高三羧酸循環，有助于降低乙酰輔酶A在肝臟內的蓄積，可能降低IMP促進體內脂肪酸過度氧化對身體產生的損傷，綜上所述，本研究結果為清淡飲食和適當運動有利于身體健康提供了新的科學依據。

綜上，IMP和AMPK形成復合體后可提高AMPK磷酸化水平，可顯著活化肝臟內脂肪酸氧化通路。動物體內三羧酸循環活性低下時，在肝臟部位容易形成乙酰輔酶A蓄積，為抵抗乙酰輔酶A蓄積引發的應激反應，肝臟產生ROS將其氧化分解和將其用于合成TG、TC等，在衰老動物體內造成肝氧化應激損傷，并進一步加劇脂質代謝紊亂。