建立檢測禽流感病毒抗體的液相蛋白芯片方法

劉向楠 叢鋒 關劍池 劉賢旭

1.廣東科貿職業學院動物科技學院 510430

2.廣東省實驗動物監測所 510000

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起多種禽類發生感染和死亡的一種重要動物疫病，嚴重危害世界養禽業發展和公共衛生安。目前，血凝抑制和酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測是實驗室檢測AIV 抗體的主要技術方法。但是，血凝抑制試驗1%紅細胞懸液的制備需要新鮮配制和保存，結果判讀主觀性較強。ELISA 試劑盒成本較高，無法實現多重抗體檢測。而本研究采用的液相蛋白芯片技術（Flexible Multi Analyte Profiling，xMAP）作為一種新型的高通量檢測技術，具有多重檢測和靈敏度高的技術優勢，已普遍用于實驗動物疫病抗體檢測，在畜牧獸醫領域研究較少，尚未商品化應用。

本研究建立了檢測AIV 抗體的xMAP 檢測方法，豐富了AIV 檢測技術方法，具有解決臨床上高通量抗體檢測的潛力，為禽流感的診斷、檢測及防控提供了一種新的技術手段。

1 材料與方法

1.1 試劑禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H2N2核蛋白（Nucleoprotein，NP 蛋白）購自廣州千尋生物技術有限公司。馬立克病毒（Marek's disease virus，MDV）陽性血清、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）陽性血清、AIV 陽性血清、SPF 雞血清購自哈爾濱維科生物科技有限公司。傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）陽性血清、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）陽性血清、傳染性喉氣管炎（Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV）陽性血清購自中國獸醫藥品監察所。禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）陽性血清為哈爾濱國生生物有限公司的禽白血病抗體ELISA 試劑盒中陽性對照品。28 份臨床雞血清采集自廣東惠州某養雞場。

生物素標記的兔抗雞IgG 購自Solarbio 公司，藻紅蛋白標記的鏈霉親和素（SAPE）購自Invitrogen 公司。xMAP 磁珠購自Luminex 公司。禽流感ELISA 抗體檢測試劑盒購于西班牙海博萊公司。

1.2 儀器液相芯片檢測系統Luminex 2000，渦旋振蕩儀，超聲儀，搖床，磁力板等。

1.3 蛋白抗原性分析按經驗值將NP 參考蛋白偶聯試劑盒說明書偶聯到xMAP 磁珠，蛋白濃度為8μg/ 106 磁珠，將有偶聯后的磁珠稀釋至50 個/μL，取50μL 稀釋后的磁珠加入96 孔板。以禽流感陽性血清為陽性對照，以SPF 級雞陰性血清作為陰性對照，分別1 ∶100 倍稀釋，每孔加入50μL 稀釋后血清，混勻后室溫震搖2 小時。洗液洗2 遍后，按100μL/孔加入2mg/L 的生物素標記二抗，室溫振搖30 分鐘。洗液洗2 遍后，按100μL/孔加入2mg/L 的SAPE，室溫振搖30分鐘。洗液洗2 遍后加入100μL/孔洗液，在液相芯片檢測系統Luminex 2000 上讀取MFI 值，并計算陽性血清熒光信號值（MFI）值與陰性MFI 值的比值，即P/N 值。若P/N 值＞5，表明包被的蛋白抗原性較好，值得進一步優化反應條件。

1.4 xMAP 檢測條件的優化將NP 蛋白按1、2、4、8、16和32μg/106磁珠的濃度分別包被磁珠。將AIV 陽性血清和SPF 雞血清分別稀釋25 倍，隨后作2 倍倍比稀釋，按照1.3的方法檢測。上機讀取MFI 值，計算對應稀釋倍數陽性血清與陰性血清的MFI 比值（P/N 值）；以檢測靈敏度最高且P/N 最大的蛋白包被濃度為抗原最佳工作濃度。

1.5 特異性試驗將AIV、IBV、ILTV、AIV、NDV、MDV、IBDV 和ALV 陽性血清進行1 ∶100 稀釋，按優化后的NP 蛋白包被濃度檢測上述血清，并使用SPF 雞血清作陰性對照血清，驗證特異性，方法同1.3。

1.6 靈敏性試驗將AIV 陽性血清稀釋25 倍，隨后作2 倍倍比稀釋，按優化后的NP 蛋白包被濃度檢測上述血清，SPF雞血清作為陰性對照，PBS 作為空白對照，檢驗靈敏性。

同時使用商品化ELISA 試劑盒同步檢測，具體操作按照試劑盒說明書進行：通過對比兩種方法檢出陽性的血清最低稀釋倍數來比較兩種檢測方法的靈敏度。

1.7 重復性試驗用所建立的方法對1∶200 稀釋陽性血清進行重復性檢測，同一批內每個檢測樣品進行3 次重復測定，對MFI 值進行統計，計算批內變異系數（CV）。對上述樣品進行3次測定，計算同一樣品測定結果之間的批間變異系數（CV）。

1.8 臨床樣本的檢測利用所建立的xMAP 方法和商品化ELISA 試劑盒對收集到的28 份臨床樣本進行檢測，對比兩者的陽性檢出率及符合率。

2 結果

2.1 AIV xMAP檢測方法建立將重組蛋白包被熒光磁珠后，用AIV陽性對照血清，陰性血清對照作為檢測樣品，進行間接免疫試驗，經Luminex 200儀器檢測，結果如圖1 所示，陽性血清的MFI 值高達7789.5，陰性血清僅66.5-76，二者差異明顯，說明包被的AIV NP 重組蛋白能夠很好地識別AIV 陽性血清，抗原性較好。

圖1 NP 蛋白xMAP 檢測AIV 陽性血清和陰性血清

2.2 AIV 重組抗原最佳包被濃度確定每1×106個磁珠分別包被1μg，2μg，4μg，8μg，16μg，32μg 共6 個濃度，按照1.3 的檢測方法進行檢測，結果表明16μg/1×106個磁珠的包被濃度時P/N 平均值最高，達198.08，最終確定使用16μg/1×106個磁珠的包被濃度（表1 和表2）。

表1 不同濃度NP 蛋白包被MFI 值

表2 不同濃度NP 蛋白包被的P/N 值

2.3 特異性的檢測采用建立的xMAP 方法對NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV、MDV 和ALV 陽性血清進行檢測，驗證該方法的特異性。結果除AIV 為陽性外，其他病毒血清均為陰性（P/N 值小于2.5），不存在交叉反應，表明建立的方法具有良好的特異性（表3 和圖2）。

表3 xMAP 檢測AIV 的特異性檢測

圖2 特異性實驗的結果

2.4 xMAP 與ELISA 的靈敏度比較

xMAP 與ELISA 分別檢測稀釋度1∶25～1∶409600的AIV 陽性血清。結果顯示，xMAP 能檢測到的AIV陽性血清的最高稀釋度為1∶ 102400；而ELISA 能檢測到的最高稀釋倍數為1∶100（表4 和圖3）。

圖3 xMAP 與ELISA 方法檢測AIV 的靈敏度

表4 xMAP 與ELISA 方法檢測AIV 的靈敏度

2.5 重復性實驗結果使用所建立的方法對1 ∶200 倍數稀釋的陽性血清和陰性對照血清進行重復檢測，同一次實驗對陽性樣品作3 次重復測定，讀取MFI 值并計算其P/N 值，統計P/N 值并計算批內變異系數（CV 值）；重復上述實驗3次，對比不同次實驗里的批內變異系數，對不同次實驗的平均P/N 值統計并計算其批間變異系數。

三次重復實驗的批內變異系數分別為1.97%，3.36%，1.18%，其中最大值為3.36%；批間變異系數為7.66%。以上結果均小于10%，表明該檢測方法具有較好的重復性（表5）。

表5 重復性實驗結果

2.6 臨床樣品檢測應用建立的AIV xMAP 方法與ELISA 方法比較，對28 份臨床樣樣本進行檢測，檢測結果見表6。AIV 檢測中，xMAP 檢測出28 例陽性，0 例陰性；ELISA 檢測出28 例陽性，0 例陰性。兩種檢測方法結果相符（表7）。

表6 xMAP 與ELISA 檢測臨床樣本結果比較

注：下劃線為陽性

表7 xMAP 與ELISA 的符合率

3 結論

本研究初步建立了AIV 抗體的xMAP 檢測方法；確定了AIV NP 蛋白的最佳抗原包被濃度為16μg/106個磁珠。特異性實驗結果顯示所建立的方法與ILTV、IBV、NDV、MDV、IBDV、ALV 陽性血清沒有交叉反應，表明該方法特異性良好。對AIV 陽性血清檢測的靈敏度高于ELISA 方法1024 倍。重復試驗中，批內CV 值最高為3.36%，批間CV 值為7.66%，表明重復性較佳。對28 份臨床樣品檢測與ELISA 結果相符。綜上，本研究建立了一種特異性、靈敏性和重復性均良好的xMAP 檢測方法。但xMAP 檢測的優勢在于多重檢測，本研究僅建立了AIV 抗體檢測方法，尚不能發揮多重檢測的優勢，有待于進一步建立ILTV、IBV、NDV 等病原抗體的xMAP 方法，然后聯合使用。本研究采集臨床樣品的雞場均免疫了禽流感疫苗，檢測結果100%陽性率，表明免疫程序規范均產生抗體。推測因免疫后抗體水平較高，因此即使檢測靈敏度較低的ELISA 方法仍100%檢出。