奶牛乳房炎葡萄球菌的分離鑒定及藥敏試驗

李瀟 陳娟 何菊 周繼國 羅元宇 程方俊

1.貴州省盤州市動物防疫監測服務站 553537

2.貴州省六盤水市農業科學院 553600

3.貴州省六盤水市水城區動物疫病預防控制中心 553600

4.貴州省威寧縣農業農村局 553100

5.西南大學 402460

奶牛乳房炎是由物理，化學或微生物等因素刺激侵入奶牛乳腺所引發的一種炎癥反應，其發病率比較高，表現為奶牛產奶量下降，發情期延長，繁殖性能降低。而葡萄球菌是引起奶牛乳房炎主要的細菌之一，該菌在食物中被人攝入后，可引起食物中毒。

本研究是對榮昌區不同奶牛場的78 份奶牛中檢測有乳房炎的27 份牛奶乳樣進行細菌分離，并檢測細菌對抗菌藥物的敏感性，篩選出針對葡萄球菌的敏感藥物，從而為奶牛乳房炎的防治，臨床指導及葡萄球菌的耐藥性研究，提供理論依據。

1 材料

普通瓊脂培養基；兔血；高鹽瓊脂培養基；LB 營養肉湯；革蘭氏染色液；各類抗生素藥物藥敏紙片；細菌生化管；細菌基因組DNA 提取試劑盒；PCR 擴增反應試劑盒（寶生物工程有限公司）；DNA 膠回收試劑盒；DNA Marke；16S rRNA 基因引物（由武漢金開瑞有限公司合成）。

立式壓力蒸汽滅菌鍋、電泳儀、梯度PCR儀、冷凍離心機、雙人單面凈化工作臺、接種環、顯微鏡和移液槍等。

2 方法

隨機采取榮昌區幾個奶牛場的泌乳奶牛乳樣78 份。采集乳樣之前先用溫水來清洗乳房，并消毒乳頭及和周圍部分。收集樣品時，棄掉前三把奶、后取10mL 左右的乳樣擠入滅菌好的試管中，標記好試管，并詳細記錄。

進行CMT 試驗來判斷患有隱性乳房炎的情況，按照農業部所制定的《奶牛乳房炎防治技術指南（試行）》進行診斷。

吸取每個乳樣的100ul,傾注于兔鮮血平板和LB 固體平板上，37℃溫箱培養24h 后，觀察菌落形態，挑起可疑單個菌落少許進行下一步純化后革蘭氏染色，鏡檢,當出現藍紫色葡萄串珠狀的細菌初步懷疑為葡萄球菌。

將分離菌株分別進行凝固酶試驗、溶血作用、產生色素、發酵木糖、發酵甘露醇、堿性磷酸酶、發酵麥芽糖相關試驗等，置于37℃恒溫箱中培養24h～48h，觀察并記錄結果。具體步驟參照東秀珠《常見細菌系統鑒定手冊》進行。

提取葡萄球菌基因組DNA 進行PCR 擴增，以基因組DNA 為模板，反應引物為細菌16SrRNA 基因通用引物。PCR 擴增采用25μl 體系：PCR 酶12.5μl,滅菌雙蒸水8.5μl，提取的基因組2.0μl,上游引物1μl，下游引物1μl。反應條件：94℃預變性10 min；94℃變性30s，45℃退火30s，72℃延伸90s 經35 個循環；最后72℃延伸10 min。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察目的條帶，結果照相保存；PCR 產物按照PCR 產物凝膠回收試劑盒說明書進行膠回收，回收產物由公生物技術公司進行測序。

將培養好的葡萄球菌肉湯與0.5 號麥氏標準管濁度進行比濁后，用滅菌好的涂菌棒將20uL 葡萄球菌菌液均勻涂于整個平板表面。邊涂邊轉動平皿重復3 次，使得接種細菌充分的分布在營養瓊脂平板表面，放置1～2min,倒置放于37℃培養箱中培養24h 后用游標卡尺測量其紙片的抑菌直徑。

3 結果

3.1 CMT 試驗結果78 份乳樣檢測出有27 份患有隱性乳房炎，部分結果如圖1。

圖1 CMT 試驗判定

3.2 形態學觀察葡萄球菌在鮮血營養瓊脂平板培養24h 后出現圓形或者橢圓形凸起、光滑、濕潤、表皮葡萄球菌菌落乳白或灰白，實心圓葡萄串狀，該菌以單，雙葡萄狀排列，不透明，直徑約1.5～2mm（圖2）；在高鹽瓊脂上菌落特征生長初期基本同血液瓊脂平板,金黃色葡萄球菌出現黃玉米色（圖3）；鏡檢結果顯示，該菌為革蘭氏陽性菌（圖4）

圖2

圖3

圖4

3.3 生化鑒定結果經生化鑒定R3 為金黃色葡萄球菌，R5為表皮葡萄球菌，R1 為溶血葡萄球，RC4 為腐生葡萄球菌。

3.4 電泳結果經16S rRNA 基因擴增，獲得凝膠電泳片段與目的片段大小相符（圖5）。PCR 產物經膠回收試劑盒純化后，送至生物公司測序。

圖5 PCR 擴增的16S rRNA 電泳結果

3.5 藥敏試驗結果根據2008 年美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）推薦的標準按敏感、中介、耐藥三級報告判定。結果顯示該16 株分離菌對環丙沙星、諾氟沙星、多西環素、麥迪霉素和氧氟沙星等抗生素敏感性較高。

4 分析與討論

該研究結果表明：一、用CMT 試驗檢測出榮昌區患有隱性乳房炎奶牛的發病率為34.6%，發病率低于其他地區，這可能與榮昌奶牛養殖場近年來飼養管理水平提高有一定關系。二、檢測的27 份患有乳房炎奶樣中共鑒定出葡萄球菌有16 株，其金黃色葡萄球菌的檢出率較低，可能是不同地區對奶牛乳房炎葡萄球菌的檢出率不同。三、藥敏試驗結果顯示：檢出的葡萄球菌對環丙沙星、諾氟沙星、多西環素、麥迪霉素和氧氟沙星高度敏感，敏感率均在88%以上，對青霉素和多粘菌素B 耐藥。通過這次的研究結果可以為該地區奶牛乳房炎進行治療并提供參考依據。