當(dāng)歸芍藥散防治非酒精性脂肪肝作用與腸道微生態(tài)的相關(guān)性研究*

河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院 河北省高校中藥組方制劑應(yīng)用技術(shù)研究中心

于澤鶴 彪雅寧 張睦清△ 劉晨旭 李子璇 韓一鷺 張一昕(石家莊 050200)

提要 目的：研究探討當(dāng)歸芍藥散防治非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用與腸道微生態(tài)的相關(guān)性。方法：60只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性藥組以及當(dāng)歸芍藥散低、中、高劑量組，每組10只。通過喂飼高脂飼料復(fù)制NAFLD大鼠模型，造模同時給予相應(yīng)藥物治療，8周后，采集血清、肝組織和大鼠糞便，檢測血清中膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和肝組織中TC、TG及游離脂肪酸(FFA)的含量或活性；蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化；16sRNA測序法分析糞便腸道菌群組成結(jié)構(gòu)。結(jié)果：模型組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴空泡積聚和氣球樣變，血清中TC、TG、ALT、AST以及肝組織中TC、TG、FFA的含量或活性均顯著升高(P<0.01)，Simpon指數(shù)、厚壁菌門相對豐度和厚壁菌門/擬桿菌門的數(shù)值顯著升高(P<0.01)，Chao1、Ace、Shannon指數(shù)、擬桿菌門相對豐度均顯著降低(P<0.01)。與模型組相比，當(dāng)歸芍藥散各劑量組大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴空泡積聚和氣球樣病變均明顯改善，血清中TC、TG、ALT、AST和肝組織中TC、TG、FFA的含量或活性均明顯降低(P<0.05或P<0.01)，Chao1、Ace、Shannon指數(shù)、擬桿菌門相對豐度均明顯升高(P<0.01)，Simpon指數(shù)、厚壁菌門相對豐度和厚壁菌門/擬桿菌門的數(shù)值均顯著降低(P<0.01)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，厚壁菌門、擬桿菌門分別與血脂含量呈正、負(fù)相關(guān)。結(jié)論：當(dāng)歸芍藥散可能通過改善腸道菌群紊亂進(jìn)行脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，進(jìn)而發(fā)揮降脂護(hù)肝的作用。

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝損傷[1]。流行病學(xué)顯示，NAFLD在我國患病率約為15.0%，已經(jīng)超過了病毒性肝炎和酒精性脂肪肝病，成為我國第一大慢性肝病[2-3]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，新近研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)對NAFLD的發(fā)生發(fā)展具有重要的影響，腸道菌群失調(diào)可通過膽汁酸代謝、內(nèi)毒素血癥、內(nèi)源性乙醇等直接誘導(dǎo)NAFLD的發(fā)生[4]。當(dāng)歸芍藥散出自《金匱要略》，原治婦人腹痛，有祛濕消痰、活血化瘀、調(diào)和肝脾之效，與NAFLD“肝脾失調(diào)，痰瘀互結(jié)”的病機(jī)相恰合。臨床資料和實(shí)驗研究表明當(dāng)歸芍藥散可降低實(shí)驗性高脂大鼠和血脂異常患者的血脂含量[5-6]，但其作用機(jī)制尚不明確。故本實(shí)驗采用高脂飼料復(fù)制NAFLD大鼠模型，從腸道微生態(tài)的角度探討該方防治NAFLD的機(jī)制，為臨床用藥提供實(shí)驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 SPF級SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量160～180 g，購于北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：110011200110219587，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006。

1.2 實(shí)驗藥物 當(dāng)歸芍藥散組成：當(dāng)歸10 g，白芍、赤芍、川芎、澤瀉各24 g，麩炒白術(shù)、茯苓各12 g。方中所用藥物均為廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒，批號分別為0090273、0085633、0093093、0096173、0093073、0091283、0100213；多烯磷脂酰膽堿膠囊(北京賽諾菲制藥有限公司，商品名易善復(fù)，228 mg/粒，2粒/次 ，3次/d)，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20059010，生產(chǎn)批號：ABJD069B，以上藥物均用100 ℃蒸餾水配制成所需濃度的藥液。

1.3 實(shí)驗試劑與儀器 總膽固醇(TC)，甘油三酯(TG)，游離脂肪酸(FFA)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號分別為A111-2-1、A110-2-1、A042-1-1、C009-2-1、C010-2-1)均購于南京建成生物工程研究所有限公司；QIAampDNA提取試劑盒(批號：51604)購于上海恒斐生物科技有限公司；Humalyzer2000型半自動生化儀(德國Millimeter Mike公司)；1-15K型高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma公司)；RM2016型切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；DP73型數(shù)碼顯微鏡(日本OlymPus公司)；Illumina MiSeq測序儀(美國Illumina公司)。

1.4 動物分組、造模及給藥 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量分層原則分為正常組、模型組、陽性藥(易善復(fù))組(0.144 g/kg)、當(dāng)歸芍藥散低劑量(2.44 g/kg)、中劑量(4.88 g/kg)和高劑量組(9.76 g/kg)，每組10只。除正常組喂養(yǎng)普通飼料外，其余各組均給予高脂飼料(78.8%基礎(chǔ)飼料+15%豬油+5%蔗糖+1%膽固醇+0.2%膽酸鈉)建立NAFLD模型。造模同時各用藥組給予相應(yīng)藥液進(jìn)行灌胃，正常組和模型組給予等量蒸餾水，給藥劑量10 mL/kg，連續(xù)給藥8周。

1.5 標(biāo)本采集 于最后1次灌胃后麻醉大鼠，股主動脈取血，置潔凈試管中，分離血清冷貯；迅速剖取部分肝組織-20 ℃冷藏；另取0.5×0.5×0.5 cm3大小的肝組織，4%多聚甲醛固定；收集各組大鼠糞便，置于凍存管中液氮保存。

1.6 指標(biāo)檢測及方法

1.6.1 血清和肝組織生化指標(biāo)檢測：半自動生化分析儀檢測血清中TC、TG、ALT和AST的含量或活性以及肝組織中TC、TG的含量、手動生化法檢測肝組織中FFA的含量，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6.2 HE染色法觀察肝組織的病理形態(tài)學(xué)變化：將4%多聚甲醛液中固定的肝臟取出，常規(guī)脫水處理、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化。

1.6.3 糞便DNA提取與16sRNA測序分析：根據(jù)治療效果，選用正常組、模型組和治療效果較好的當(dāng)歸芍藥散高劑量組的大鼠糞便進(jìn)行腸道菌群分析。從糞便中提取腸道微生物DNA，同時采用NanodroP對DNA進(jìn)行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。采用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R引物(5′-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3′)對提取出來的DNA中V3～V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將純化后的PCR進(jìn)行熒光定量，采用TruSeq Nano DNA LT Library PreP Kit制備測序文庫，將獲得的DNA片段用Illumina MiSeq測序平臺進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中TC、TG含量和ALT、AST活性變化情況 與正常組比，模型組大鼠血清中TC、TG含量以及ALT、AST的活性均明顯升高(P<0.01)；與模型組比，各用藥組大鼠血清中TC、TG含量和ALT、AST的活性均明顯降低(P<0.01)；中劑量組大鼠血清中ALT和高劑量組ALT、AST的活性均明顯低于陽性藥組和低劑量組(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠血清中TC、TG、ALT和AST含量或活性的比較

2.2 各組大鼠肝臟脂質(zhì)的含量變化 與正常組比，模型組大鼠肝臟中TC、TG和FFA的含量均明顯升高(P<0.01)；與模型組比，各用藥組大鼠肝組織中TC、TG和FFA的含量均明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與陽性藥組比，低劑量組大鼠肝組織中TC含量明顯升高(P<0.05)，高劑量組大鼠肝組織中TC含量明顯降低(P<0.05)；與低劑量組比，中、高劑量組大鼠肝組織中TC含量均明顯降低(P<0.01)。詳見表2。

表2 各組大鼠肝組織中TC、TG和FFA含量的比較

2.3 各組大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)變化 HE染色結(jié)果提示：正常組大鼠肝小葉清晰，肝細(xì)胞大小均勻，肝細(xì)胞索排列整齊，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，胞漿均勻，細(xì)胞核圓且位于中央；模型組大鼠肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)可見大量的脂滴空泡積聚和較多的氣球樣變；與模型組比，各用藥組肝細(xì)胞的脂滴空泡積聚和氣球樣變均減輕，尤以高劑量組改善明顯。

2.4 Alpha多樣性指數(shù) Alpha多樣性指數(shù)可以反映腸道菌群的豐富度和多樣性，包括Chao、Ace、Simpson和Shannon指數(shù)，其中Chao和Ace數(shù)值越大，說明物種豐富度越高；Simpson指數(shù)越小，Shannon指數(shù)越大，說明物種多樣性越高。結(jié)果顯示，與正常組比，模型組Chao1、Ace以及Shannon指數(shù)均明顯降低(P<0.01)，Simpson指數(shù)明顯升高(P<0.01)，說明模型組大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性均降低。與模型組比，當(dāng)歸芍藥散高劑量組Chao1、Ace以及Shannon指數(shù)均明顯升高(P<0.01)，Simpson指數(shù)明顯降低(P<0.01)，表明當(dāng)歸芍藥散高劑量可升高模型大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性。詳見表3。

表3 各組大鼠Alpha多樣性指數(shù)比較

2.5 各組大鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)分析及優(yōu)勢菌與血脂含量相關(guān)性分析 16sRNA測序結(jié)果顯示，在門分類學(xué)水平上有厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、TM7、疣微菌門(Verrucomicrobia)等10類主要細(xì)菌，其中厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌。見圖1。

注：C-正常組，M-模型組，G-當(dāng)歸芍藥散高劑量組(下同)。圖1 大鼠腸道菌群組成情況

對各組優(yōu)勢菌相對豐度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：與正常組和當(dāng)歸芍藥散比較，模型組厚壁菌門相對豐度明顯升高(P<0.01)，擬桿菌門相對豐度顯著降低(P<0.01)。比較2個優(yōu)勢菌的比值，模型組中厚壁菌門與擬桿菌門比值明顯高于正常組(P<0.01)，而當(dāng)歸芍藥散高劑量組中二者的比值明顯低于模型組(P<0.01)。見圖2、圖3。

注：與正常組比，**P<0.01；與模型組比，## P<0.01。

注：與正常組比，**P<0.01；與模型組比，## P<0.01。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，厚壁菌門與血清中TC和TG的含量成正相關(guān)(P<0.01)，擬桿菌門與血清中TC和TG的含量成負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見圖4。

注：r<0 為負(fù)相關(guān)，r>0 為正相關(guān)，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

3 討論

中醫(yī)學(xué)中并沒有NAFLD這一病名，根據(jù)其致病特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，將其歸屬為“脅痛”“積聚”“痰濁”等范疇。NAFLD多是由于過食精肥甘甜、所欲不遂、怠惰懶動等原因?qū)е缕⑦\(yùn)失職，濕聚成痰；肝失疏泄，氣機(jī)不暢，氣滯則血瘀，痰瘀互結(jié)于肝而成，故肝脾失調(diào)，痰瘀互結(jié)為其主要病機(jī)，消痰化瘀，調(diào)肝運(yùn)脾為其有效治法。

《金匱要略·婦人妊娠病脈證并治第二十》記載“婦人懷妊，腹中疞痛，當(dāng)歸芍藥散主之”。方中當(dāng)歸、芍藥配用養(yǎng)肝血、祛瘀滯，川芎暢肝行氣、活血化瘀，為“血中氣藥”，3味血藥同用，共奏養(yǎng)血活血、調(diào)肝化瘀之功，重在調(diào)肝。白術(shù)、茯苓相合培土健脾、燥濕利水，澤瀉淡滲利水、祛濕消痰，3味水藥伍用，既可益氣健脾以杜絕水濕痰濁生成之源，又可消散已成之痰濕，合以治脾。全方3血3水之品，相濟(jì)并用，肝脾同調(diào)，血濕同治，共成祛濕消痰、活血化瘀、調(diào)和肝脾之效。當(dāng)歸芍藥散的組方用藥與NAFLD病機(jī)相恰合，根據(jù)中醫(yī)學(xué)“異病同治”的原則，故選為該病的治療方劑。

腸道菌群與宿主形成共生關(guān)系，有調(diào)節(jié)宿主免疫功能、防止外來微生物入侵、調(diào)節(jié)能量代謝等功能[7]。小腸中未被消化吸收的碳水化合物是腸道菌群的主要養(yǎng)料來源，若長期進(jìn)食高脂食物，可使腸道菌群的養(yǎng)料減少，同時，高脂飲食的部分代謝產(chǎn)物可破壞腸道菌群所處的微生態(tài)環(huán)境，從而導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[8]。擬桿菌門和厚壁菌門為腸道菌群的兩大優(yōu)勢菌，約占腸道菌群含量的99%[9]。擬桿菌門與代謝性疾病呈負(fù)相關(guān)，厚壁菌門則與之呈正相關(guān)，二者的比值能夠影響肌體對熱量的吸收。若厚壁菌門數(shù)量高于擬桿菌門，則肌體吸收熱量會增加，反之則減少[10]。已有研究表明，在NAFLD模型大鼠腸道中，厚壁菌門/擬桿菌門的數(shù)值明顯高于正常組[11]，且腸道中厚壁菌門每增加20%，擬桿菌門每減少20%，宿主就會增加約150 kcal的能量攝入[12]。

本實(shí)驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型大鼠經(jīng)當(dāng)歸芍藥散治療后，血脂和肝臟脂質(zhì)含量均明顯降低，肝損傷減輕，肝細(xì)胞中脂滴空泡積聚和氣球樣變均明顯改善，表明當(dāng)歸芍藥散有良好的降脂保肝效果。Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果顯示，模型大鼠腸道菌群的豐富度和多樣性降低，與文獻(xiàn)報道的高脂飲食可降低腸道菌群物種的豐富性與多樣性相一致[13-14]，而當(dāng)歸芍藥散可恢復(fù)模型大鼠腸道菌群物種的豐富性與多樣性。模型組大鼠厚壁菌門相對豐度和厚壁菌門與擬桿菌門的比值明顯升高，擬桿菌門相對豐度明顯降低，當(dāng)歸芍藥散可明顯降低NAFLD大鼠厚壁菌門相對豐度以及厚壁菌門與擬桿菌門的比值，明顯升高擬桿菌門相對豐度。腸道菌群與血脂含量相關(guān)性分析結(jié)果表明，厚壁菌門豐度與血清中TC和TG的含量成正相關(guān)，擬桿菌門豐度與血清中TC和TG含量成負(fù)相關(guān)，可見當(dāng)歸芍藥散的降脂護(hù)肝作用與腸道菌群密切相關(guān)。綜上可知，當(dāng)歸芍藥散防治NAFLD的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。