高通量測序研究濃香型酒醅的細菌菌群多樣性及共變性

陳慧穎， 李慧星， 許 彬， 曹 斌， 王春艷,3 1.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030； .南陽理工學院河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004； 3.南陽理工學院生物與化學工程學院，河南 南陽 473004

白酒是我國傳統的蒸餾酒，酒醅中微生物的組成及其變化規律對白酒品質具有重要影響[1]。酒醅細菌在白酒生產中起著關鍵作用，一是參與白酒生產主要代謝途徑；二是增加白酒風味；三是豐富白酒活性成分[2,3]。然而與酒曲和窖泥相比，酒醅細菌菌群的相關研究仍然較少[3]。

高通量測序技術可以快速分析復雜體系的微生物菌群，且提供全面準確的菌群信息[4,5]，已被應用于不同香型白酒酒醅的細菌菌群研究[6-12]。ZOU等[6]指出瀘型白酒酒醅中芽孢桿菌屬Bacillus和乳桿菌屬Lactobacillus是優勢菌屬。Jing[7]等基于高通量測序分析兩個品牌醬香型酒醅的細菌多樣性，變形桿菌門Proteobacteria和厚壁菌門Firmicutes的相對豐度高，乳桿菌屬Lactobacillus和假單胞菌屬Pseudomonas的相當豐度隨著發酵時間延長不斷增加。邢敏鈺等[8]采用高通量測序分析芝麻香型酒醅的乳酸菌菌群，發現了5個屬的乳酸菌，它們分別是魏斯氏菌屬Weissella、片球菌屬Pediococcus、乳桿菌屬Lactobacillus、明串珠菌屬Leuconostoc和乳球菌屬Lactococcus。

濃香型是中國白酒的重要香型之一，占市場份額70%以上[13,14]。濃香型酒醅的微生物菌群是學者們的研究熱點[15-29]。SUN等[27]采用高通量測序分析濃香型酒醅的細菌多樣性，結果表明醋桿菌屬Acetobacter和乳桿菌屬Lactobacillus為豐度最高的物種，與冬季酒醅相比，夏季酒醅的乳桿菌屬Lactobacillus豐度增加，醋酸桿菌屬Acetobacter豐度降低。翟磊等[28]采用高通量技術研究發現宜賓產區濃香型酒醅中細菌主要以片球菌屬Pediococcus、乳桿菌屬Lactobacillus和瘤胃球菌屬Ruminococcus為主，其中片球菌和乳桿菌為主的乳酸菌是發酵中后期的優勢細菌。高江婧[25]等研究發現濃香型酒醅整個發酵過程中，隨著發酵時間的延長，乳桿菌科Lactobacillaceae和腸桿菌科Enterobacteriaceae的相對豐度降低，瘤胃菌科Ruminococcaceae和梭菌科Clostridiaceae微生物的相對豐度增加。胡曉龍[29]等采用高通量測序技術分析了賈湖酒醅微生物群落，發現乳桿菌屬Lactobacillus是發酵中、后期酒醅中的絕對優勢微生物，同時間節點下各層酒醅的微生物聚類沒有明顯規律。不同香型白酒酒醅的細菌菌群有差異性，相同香型不同來源的白酒酒醅的細菌菌群同樣存在差異。然而，當前研究多集中于某個酒廠酒醅發酵過程的功能細菌[20-24]、細菌菌群多樣性及其與風味物質的關聯[25-29]，而對酒醅細菌菌群的共性變化規律研究較少。實驗取樣于河南三個不同濃香型白酒廠的酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)，采用的Illumina MiSeq高通量測序技術分別研究入窖酒醅和出窖酒醅的細菌菌群，依次在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)和屬(genus)5個水平上進行分析，一方面展示河南濃香型白酒入窖酒醅和出窖酒醅的細菌微生物多樣性；另一方面，分析三個不同酒廠的酒醅發酵后細菌菌群的共性變化規律，為深度探究白酒酒醅的細菌菌群提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

濃香型酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)樣品分別取自于河南南陽社旗、濮陽南樂和周口鹿邑的三個白酒廠[30]，入窖酒醅分別命名為EFG-1，EFG-2，EFG-3；出窖酒醅分別命名為OFG-1，OFG-2，OFG-3。

1.2 實驗方法

實驗方法和數據分析參考文獻[5]。PCR所用的引物已經融合了Miseq測序平臺的V3-V4通用引物。341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTA CHVGGGTATCTAATCC。

2 結果與分析

2.1 測序序列數目和多樣性指數分析

濃香型酒醅樣品經高通量測序和質量控制后，獲得有效序列。根據差異水平在0.03(即相似度97%)的水平上聚類得到操作分類單元(OTU)。由表1可以看出：樣品測序的覆蓋率均大于95%，表明測序結果代表樣品的真實情況。三個入窖酒醅樣品(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的有效序列數量分別是34 219、45 593和32 362，聚類得到OTU數目分別為5 681、7 684和4 221；三個出窖酒醅樣品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的有效序列數量分別是31 978、33 265和40 932，聚類得到OTU數目分別為3 792、3 091和1 811。在序列聚類獲得OTU的基礎上，分別采用Shannon指數和Chao1指數描述菌群物種的多樣性，其中Shannon指數和Chao1指數越大，說明群落多樣性越高。EFG-1、EFG-2和EFG-3的Shannon指數和Chao1指數均大于OFG-1、OFG-2和OFG-3的Shannon指數和Chao1指數，說明入窖酒醅的細菌菌群多樣性高于出窖酒醅的細菌菌群多樣性。濃香型酒醅經過發酵后細菌菌群的物種多樣性降低。這是由于濃香型酒醅發酵是在厭氧條件下的產酶、產酸、產酒精等復雜過程，入窖酒醅的細菌微生物在發酵過程中不斷衰亡后分解[29]。

表1 OTU數量及多樣性指數

實驗依次在門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)和屬(genus)5個分類水平上進行分析，通過酒醅樣品的細菌菌群分布和變化趨勢來闡釋酒醅中細菌菌群的多樣性和共變性。為了使細菌菌群分布的顯示效果較好，實驗選取相對豐度較大的前15個物種，將相對豐度較低的部分合并為Other顯示在圖上。細菌菌群變化趨勢是在細菌菌群分布的基礎上，將三個入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和三個出窖酒醅樣品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)分別進行比較，分析出三個不同來源濃香型酒醅發酵后具有相同和顯著變化趨勢的細菌物種。

2.2 在門(Phylum)水平上濃香型酒醅的細菌菌群

圖1為在門(Phylum)水平上濃香型酒醅的細菌菌群，可以看出：入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的優勢菌群均是厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus，它們的相對豐度分別為8.86%～90.3%、7.38%～63.34%、0.08%～16.2%、2.04%～9.96%和0.13%～4.99%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細菌菌群分布，圖2顯示了出窖酒醅中厚壁菌門Firmicutes的相對豐度均高于入窖酒醅中厚壁菌門Firmicutes的相對豐度，而變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria的相對豐度降低。

圖1 在門水平上濃香型酒醅的細菌菌群

圖2 在門水平上濃香型酒醅中細菌變化趨勢

2.3 在綱(Class)水平上濃香型酒醅的細菌菌群

在綱(Class)水平上濃香型酒醅的細菌菌群如圖3所示，入窖酒醅和出窖酒醅的優勢菌群有桿菌綱Bacilli、梭菌綱Clostridia，放線菌綱Actinobacteria、α-變形菌綱Alphaproteobacteria、β-變形菌綱Betaproteobacteria和γ-變形菌綱Gammaproteobacteria，它們的相對豐度分別是7.48%～69.24%、1.2%～19.89%、0.78%～17.68%、0.12%～29.7%、0.88%～4.71%和0.48%～28.88%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細菌菌群分布，圖4顯示了在綱水平上濃香型酒醅中細菌的變化趨勢。酒醅發酵后，桿菌綱Bacilli、梭菌綱Clostridia的相對豐度均有增加，而放線菌綱Actinobacteria、α-變形菌綱Alphaproteobacteria和γ-變形菌綱Gammaproteobacteria的相對豐度明顯降低。

圖3 在綱水平上濃香型酒醅的細菌菌群

2.4 在目(Order)水平上濃香型酒醅的細菌菌群

在目(Order)水平上濃香型酒醅的細菌菌群如圖5所示，入窖酒醅和出窖酒醅的優勢菌群是乳桿菌目Lactobacillales、芽孢桿菌目Bacillales、梭菌目Bacillales、腸桿菌目Enterobacteriales、根瘤菌目Rhizobiales、微球菌目Micrococcales，它們的相對豐度分別為5.27%～62.24%、1.92%～32.59%、1.19%～19.85%、0.73%～14.78%、0.54%～13.15%和0.18%～17.09%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細菌菌群分布，圖6顯示了在目水平上濃香型酒醅的細菌變化趨勢，酒醅發酵后乳桿菌目Lactobacillales、梭菌目Bacillales的相對豐度增加，而腸桿菌目Enterobacteriales、根瘤菌目Rhizobiales、微球菌目Mi-crococcales和伯克氏菌目Burkholderiales的相對豐度降低。

圖5 在目水平上濃香型酒醅的細菌菌群

圖6 在目水平上濃香型酒醅中細菌變化趨勢

2.5 在科(Family)水平上分析濃香型酒醅的細菌菌群

在科(Family)水平上濃香型酒醅的細菌菌群如圖7所示，入窖酒醅和出窖酒醅的優勢菌群是乳桿菌科Lactobacillaceae、芽孢桿菌科Bacillaceae、高溫放線菌科Thermoactinomycetaceae、梭菌科Clostridiaceae、腸桿菌科Enterobacteriaceae和葡萄球菌科Staphylococcaceae，它們的相對豐度分別為2.62%～76.77%、0.07%～13.77%、0.02%～18.81%、0.31%～15.78%和0.73%～14.78% 和0.01%～8.22%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細菌菌群分布，圖8顯示了在科水平上濃香型酒醅的細菌變化趨勢，酒醅發酵后乳桿菌科Lactobacillaceae、梭菌科Clostridiaceae的相對豐度增加，而腸桿菌科Enterobacteriaceae、微球菌科Micrococcaceae的相對豐度降低。

圖7 在科水平上濃香型酒醅的細菌菌群

2.6 在屬(Genus)水平上分析濃香型酒醅的細菌菌群

在屬(Genus)水平上濃香型酒醅的細菌菌群如圖9所示，入窖酒醅和出窖酒醅的優勢菌有乳桿菌屬Lactobacillus、腸桿菌屬Enterobacter、短波單胞菌屬Brevundimonas、克羅彭施泰特氏菌Kroppenstedtia、節桿菌屬Arthrobacter、糖多孢菌Saccharopolyspora、葡萄球菌屬Staphylococcus，它們的相對豐度分別為1.38%～75.99%、0.15%～12.51%、0.11%～2.78%、0.02%～17.02%、0.05%～14.88%、0.03%～8.37%、0.01%～8.21%。分別比較入窖酒醅和出窖酒醅的細菌菌群分布，圖10顯示了在目水平上濃香型酒醅的細菌變化趨勢，酒醅發酵后乳桿菌屬Lactobacillus的相對豐度增加，腸桿菌屬Enterobacter、短波單胞菌屬Brevundimonas的相對豐度降低。

圖9 在屬水平上濃香型酒醅的細菌菌群

圖10 在屬水平上濃香型酒醅中細菌變化趨勢

3 結論

基于Illumina MiSeq高通量測序展示了河南濃香型酒醅的細菌微生物多樣性，入窖酒醅的細菌微生物多樣性高于出窖酒醅的細菌微生物多樣性。入窖酒醅和出窖酒醅的在門水平上的優勢菌有厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、異常球菌-棲熱菌門Deinococcus-Thermus；在屬水平上的優勢菌有乳桿菌屬Lactobacillus、腸桿菌屬Enterobacter、短波單胞菌屬Brevundimonas、克羅彭施泰特氏菌屬Kroppenstedtia、節桿菌屬Arthrobacter、糖多孢菌屬Saccharopolyspora、葡萄球菌屬Staphylococcus。在濃香型酒醅的細菌微生物多樣分析基礎上，通過分別比較三個不同酒廠的入窖酒醅和出窖酒醅的細菌菌群，可知濃香型酒醅發酵后細菌菌群的顯著共性變化規律(圖11)：厚壁菌門、桿菌綱、乳桿菌目、乳桿菌科、乳桿菌屬的相對豐度增加；變形菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科、腸桿菌屬的相對豐度降低。酒醅的細菌菌群在門、綱、目、科、屬5個分類水平上逐次分析，細菌物種變化規律無法完全可循，如根瘤菌目、伯克氏菌目、梭菌科、微球菌科的相對豐度變化在屬水平上沒有分析得到對應的細菌物種，這是由于分類水平越高，種類越多，相對豐度較低的物種變化趨勢逐漸不明顯；另一方面，隨著分類水平的提高，樣品中出現了未分類和未定地位的細菌。

圖11 濃香型酒醅發酵后細菌菌群的變化規律