植物乳桿菌AR495抑制巨噬細胞RAW264.7 向破骨細胞分化的研究

孫文妮， 楊 茜， 譚卓銘， 文富民， 陳樂蔭， 于 婧， 王光強， 艾連中， 夏永軍 上海理工大學醫療器械與食品學院 上海食品微生物工程技術研究中心，上海 200093

骨質疏松癥是由于人體骨代謝異常所致的全身性骨量減少,骨骼微細結構破壞,骨脆性增加導致骨折危險性明顯增加的一種疾病[1]。破骨細胞是一種巨大的多核細胞，起源于單核巨噬細胞/單核系造血前體細胞，在骨吸收過程中破骨細胞的形成和活性異?？蓪е鹿琴|疏松[2]。目前對骨質疏松患者的治療主要用激素替代療法，在長期服用過程中會增加患乳腺癌和心血管疾病的風險[3]。

益生菌是一類對宿主有益的微生物[4]，其中包括多種不同種屬的微生物，如乳酸菌、腸球菌、雙歧桿菌等[5]。益生菌具有調節腸道菌群平衡、保護腸道黏膜屏障、提高機體免疫力、產生抗菌化合物抵御病原體侵害等多種作用[6]。大量研究證明，乳酸菌對高膽固醇、動脈粥樣硬化、高血壓與糖尿病等疾病有較好的改善作用[7]。

益生菌的狀態對其功能發揮有重要影響。在臨床實驗中，口服巴氏滅活的阿克曼氏菌具有降低總膽固醇、減輕體重、減少脂肪量和髖部周長等效果，而活菌卻沒有這些功效[8]。一些乳酸菌如干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌細胞壁可通過調節免疫炎癥和氧化應激來減輕LPS誘導的結腸炎[9]。發酵乳桿菌的細胞壁蛋白能夠粘附于派爾淋巴結(PPs)上誘導Th1型反應而抑制病原體[10]。

近年來研究發現，益生菌在緩解骨質疏松方面有較好的應用潛力[11]。鼠李糖乳桿菌[12]、副干酪乳桿菌[13]和嗜酸乳桿菌[14]等均被證實能夠通過免疫調節來減少骨吸收，抑制破骨細胞生成。課題組前期研究篩選獲得一株具有緩解骨質疏松功能的植物乳桿菌AR495，能夠減少小鼠骨質流失。但其對破骨細胞的分化以及相應通路未知。本文考察了植物乳桿菌AR495不同處理方式(活菌、死菌等)對核因子-κB受體活化因子配基(RANKL)誘導的RAW264.7細胞向破骨細胞分化的影響，為解析其緩解骨質疏松機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株

植物乳桿菌AR495系從發酵食品中篩選獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.14004。

1.1.2主要試劑和儀器

SYBR Green(上海翌圣生物技術有限公司，中國)；DMEM完全培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS緩沖液、RANKL(美國GIBCO)；MRS培養基(北京陸橋技術股份有限公司，中國)；抗酒石酸酸性磷酸酶染液(南京建成生物工程研究所，中國)；CCK8檢測試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，中國)；RAW 264.7細胞株(中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，中國)；IL-1β ELISA快速檢測試劑盒、TNF-α ELISA快速檢測試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司，中國)。Trizol、異丙醇、三氯乙酸、無水乙醇和DEPC水均購自生工(上海，中國)。HPX.9162MBE型電熱恒溫培養箱 (上海滬粵明科學儀器有限公司，中國)；SpectraMax i3x型酶標儀(奧地利美谷分子)；UV2600型紫外分光光度計(日本島津)；湘儀L500臺式低速自動平衡離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，中國)；Ruskinn 低氧厭氧培養工作站(英國Ruskinn)；LightCycle96實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Bio-rad S1000梯度PCR儀(美國伯樂Bio-rad)；倒置顯微鏡(DMi8，德國Leica公司)；自動細胞計數器(Countess Ⅱ，美國Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1不同活性成分分組及其處理方法

將活化后的AR495接種至液體MRs培養基中，培養18 h，取1 mL培養液4 000 r/min離心10 min，取上清；將沉淀用無菌的PBS洗滌2次后重懸，得活菌；重懸后的菌體于100 ℃中水浴中熱滅活5 min；重懸后的死菌超聲破碎45 min，4 000 r/min離心10 min，取上清得胞內物；取沉淀得細胞壁。將除活菌和死菌外的組分過0.44 mm水相濾頭除菌。其中發酵液組以MRs培養基作為對照，消除培養基成分的干擾。

表1 不同活性成分分組及其處理方法

1.2.2細胞活力測定

將RAW264.7細胞以1×104cell/mL的濃度鋪于96孔板中，以DMEM完全培養基進行培養，然后分為8組，設5副孔，第1組設置為空白對照，第2組為RANKL誘導組，第3至8組為RANKL+活性成分組，第2至8組均以50 ng/mL RANKL誘導5 d，第3至8組于第3 d時加入不同組分共培養，且添加不同組分的組均調整到細胞濃度為106CFU/mL。第5 d，每孔加入10 μL CCK8試劑，于37 ℃培養箱避光孵育1 h后在450 nm下測吸光度[15]。

1.2.3細胞計數與細胞形態學觀察

將RAW264.7細胞以1×104cell/mL的濃度鋪于加細胞爬片的12孔板中，細胞分組方法同1.2.2。第5 d時，取出細胞爬片，按照抗酒石酸酸性磷酸酶染液試劑盒操作說明書進行染色。倒置顯微鏡觀察，拍照。每個處理條件拍8個隨機視野，對細胞核數量大于2個的多核破骨細胞進行計數[16]。

1.2.4TRAP酶活測定

將RAW264.7細胞以1×104cell/mL的濃度鋪于每孔含有2 mL DMEM完全培養基的12孔板中。細胞分組方法同1.2.2。第5 d時取培養液上清。按試劑盒操作說明書中步驟檢測TRAP酶活力[17]。

1.2.5ELISA測定細胞因子

取不同組分共培養5 d后的細胞培養液，離心獲取上清。用ELISA快速檢測試劑盒檢測細胞因子IL-1β與TNF-α的含量[18]。

1.2.6實時熒光定量

將RAW264.7細胞以1×104cell/mL的濃度鋪于12孔板中，在與不同組分共培養5 d后，每孔中加入1 mL Trizol，輕輕吹打細胞，收集液體于1.5 mL離心管內，于-80 ℃冰箱保存。Trizol法提取細胞的RNA，反轉錄獲得cDNA，進行實時熒光定量。

表2 實時熒光定量使用的引物

1.2.7數據統計分析

所有數據以均值±標準誤表示。使用統計軟件SPSS22.0對數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，當P<0.05有統計學差異。

2 結果與討論

2.1 植物乳桿菌AR495對RAW264.7細胞活力的影響

CCK-8試劑盒常被用于藥物篩選，可以測定在不同濃度藥物下細胞的存活率。由表3可以看出，在AR495的菌濃為106CFU/mL時，不同組分和RAW264.7細胞共培養都會降低細胞的相對活力。其中除模型組外，與巨噬細胞共培養的各組分之間均無顯著差異。這說明各組分對細胞的活力影響相似，排除了細胞相對活力對其他指標的影響。

表3 植物乳桿菌AR495與RAW264.7共培養后RAW264.7向破骨細胞分化的相關指標

2.2 植物乳桿菌AR495對RAW264.7細胞形態影響

破骨細胞分化的鏡檢結果能直觀的顯示不同組分對破骨細胞分化的抑制效果。不同組分與巨噬細胞RAW264.7共培養的結果在200倍鏡頭下如圖1所示。圖中深色單核圓形的細胞為未分化的RAW264.7細胞，顏色較淺的多核不規則細胞為分化后的破骨細胞。從不同處理組共培養后細胞的染色圖中可以看出，在AR495活菌與發酵液處理組中，每個視野下的破骨細胞數量明顯低于其他各組。巨噬細胞RAW264.7經過RANKL誘導后，RANKL與巨噬細胞表面的RANK配體結合，啟動破骨前體細胞的分化，并最終融合成多核的破骨細胞[19]。而AR495活菌與發酵液均能有效的抑制這種分化的過程。

由每個視野下破骨細胞數量的統計結果(表3)可看出，活菌組的破骨細胞數量降低了49.75%，發酵液組的破骨細胞數量降低了50.84%，而其他組的破骨細胞數量相對于模型組沒有顯著性差異。SUN[20]等利用神經肽FF干預破骨細胞分化，細胞形態變化與本研究抑制，同樣減少了多核破骨細胞數量。

2.3 植物乳桿菌AR495對RAW264.7 TRAP酶活影響

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)是一種糖基化的含金屬蛋白酶，在破骨細胞中高度表達，抗酒石酸酸性磷酸酶可以被破骨細胞釋放到血液中，幾乎被認為是是機體破骨活性的唯一血液指標[21]。表3為植物乳桿菌AR495不同處理組與巨噬細胞共培養后，每孔細胞內產生的TRAP酶活力變化。由表3可知，活菌組與發酵液組的TRAP酶活力與模型組相比降低了20.89%與49.24%，而其余各組分的TRAP酶活力與模型組相比，都不具有顯著性差異。發酵液組表現出了比活菌組更好的抑制TRAP酶的表達的能力，有效的抑制了破骨細胞的分化。與黃俊飛[22]等人施用西瑞香素抑制TRAP酶活力的結果相一致。

2.4 植物乳桿菌AR495對RAW264.7細胞炎癥因子影響

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)可介導白介素-1β(IL-1β)等細胞因子的產生，這些因子在協同作用下，會誘導破骨細胞前體分化為破骨細胞[23]。因此評價了AR495不同組分對細胞因子TNF-α與IL-1β的抑制作用。如表3所示，活菌組相對于模型組TNF-α與IL-1β的含量分別降低了141.39 pg/mL和17.09 pg/mL；發酵液組相對于模型組TNF-α與IL-1β的含量分別降低了164.37 pg/mL和14.78 pg/mL，這兩組與空白組之間均沒有顯著性差異，說明細胞內TNF-α與IL-1β的表達被抑制到與正常巨噬細胞接近的水平。而其他各組如細胞壁與胞內物組雖然相比模型組顯著性的抑制了TNF-α與IL-1β的表達，但是沒有活菌組與發酵液組的抑制效果更明顯?；罹c發酵液這兩種組分都顯示出了對促進破骨細胞分化的細胞因子的顯著抑制效果。

2.5 植物乳桿菌AR495對RAW264.7相關通路基因表達影響

圖2顯示了與AR495不同處理組與巨噬細胞共培養后細胞內信號蛋白的相對表達情況，與模型組相比較，活菌組與發酵液組均顯著性的抑制了TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB信號蛋白的表達。

核因子κB受體活化因子配體(RANKL)能夠特異性的結合并激活破骨前體細胞膜上的核因子κB受體活化因子配基(RANK)，TNF受體相關因子6(TRAF-6)將RANK的信號直接刺激NFκB的活化，并轉運活化后的NFκB進入細胞核，誘導了破骨細胞的形成，增強骨代謝機制[24]。去甲異波爾定同樣通過調節此通路抑制了破骨細胞分化[25]。Toll樣受體4(TLR4)介導的髓樣分化因子88(MyD88)依賴途徑會活化核因子κB(NF-κB)[26]，這是一條重要的炎癥通路?；罹c發酵液組對該條通路的調節與VIJAYAN[27]等人研究蛋氨酸下調破骨細胞前體中的TLR4/MyD88/NF-κB信號傳導的結果相一致。而NF-κB是RANKL/TRAF 6通路與TLR4/MyD88通路的交匯點，這兩條通路共同通過NF-κB介導下游的信號因子，誘導破骨細胞分化，引起炎癥反應。從結果中可以看出，這兩種組分是通過分別調節RANKL/TRAF6通路與TLR4/MyD88通路來共同抑制破骨細胞分化的。

3 結論

本實驗通過分析巨噬細胞活力與形態、TRAP酶活力以及細胞炎癥因子結果表明，AR495的活菌與發酵液均能顯著的抑制TRAP酶的活力以及破骨細胞的分化，抑制細胞因子TNF-α與IL-1的產生。同時通過調節RANKL/TRAF 6通路與TLR4/MyD88通路蛋白的表達來抑制破骨細胞的分化。本研究為進一步解析植物乳桿菌AR495緩解骨質疏松機制奠定了基礎。