免疫印跡法和ELISA檢測過敏原結(jié)果比較

于 瀟

（沈陽金域醫(yī)學檢驗所有限公司實驗室診斷部，遼寧 沈陽 110164）

目前在發(fā)達國家和一些地區(qū)，過敏人群眾多，約七分之一的人可以查出過敏源，發(fā)展中國家過敏性疾病發(fā)病率逐年上升，過敏為全球性嚴重的健康問題[1]。近幾年，隨著生活水平的提高，生活方式的改變，我國變態(tài)反應人數(shù)增加，目前越來越多患者需要檢測過敏原[2]。為了確診的準確性，本文比較了兩種常用過敏原檢測方法并探討免疫印跡法和ELISA檢測過敏原結(jié)果比較并選取80例標本作為臨床觀察，希望為臨床診斷提供依據(jù)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2019年1月在沈陽金域醫(yī)學檢驗所有限公司實驗室診斷的80例樣本，對血清樣本進行檢測，血清樣本為免疫印跡法檢測過敏原且另外之后用ELISA再檢測過敏原結(jié)果，比較兩組檢查方法檢驗差異。其中樣本患者年齡18～82歲，平均年齡（43±5.20）歲。臨床體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）為13.15～29.42 kg/m2，臨床基礎(chǔ)疾病高血壓5例，冠心病12例，糖尿病22例，其中變應性鼻炎32例，蕁麻疹30例，支氣管哮喘14例，其他變應性疾病4例。經(jīng)統(tǒng)計學分析樣本在年齡、體質(zhì)量與疾病類型等方面比較臨床差異均無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）并可以進行比較。

1.2 方法 Western blot試劑由德國Madth公司提供。選擇華南地區(qū)的組合并包括吸入組、草花粉組合，總免疫球蛋白E和攝入組。將試劑置于室溫下25 min，然后用清洗液潤濕硝酸纖維素膜并加入260 μL血清，在室溫下孵育43 min，用清潔液洗滌7次，加入270 μL抗抗體，然后混合。室溫孵育42 min后，漂洗，加入220 μL鏈霉親和素標志物并孵育30 min，漂洗加入230 μL底物，孵育30 min漂洗，終止底物酶反應。干燥后測試大約需要4 h。酶聯(lián)免疫吸附測定試劑采用深圳博卡生物技術(shù)有限公司提供，包括吸入組、多種動物毛發(fā)多種羽毛、蟑螂、香煙、桑蠶絲、春夏秋花粉、總免疫球蛋白E和飼料組、芝麻、維生素E蔬菜、調(diào)味品、總免疫球蛋白E。試劑在室溫下放置40 min并將60 μm的血清和IgE加入到每個孔中。120 μL樣品稀釋劑，38 ℃培養(yǎng)5 h洗滌，加入生物素抗人IgE，38 ℃培養(yǎng)40 min洗滌，加入120 μL辣根過氧化物酶-鏈霉親和素耦聯(lián)物，38 ℃培養(yǎng)40 min洗滌，加入60 μL顯色劑A和B培養(yǎng)20 min，添加D60 μL終止液，酶標記選擇雙波。在430和650 nm處讀取吸光度（OD）值。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進行分析并且P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩種方法測定家塵和肉制品中的過敏原有一定差異，差異具有臨床統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但其他過敏原無顯著差異，P＞0.05。見表1。

表1 80例樣本比較

3 討 論

Ⅰ型變態(tài)反應性疾病，主要是指過敏原第二次接觸機體后而發(fā)生的反應，可以在數(shù)分鐘后發(fā)生，主要表現(xiàn)為皮膚癥狀、呼吸道癥狀、胃腸道癥狀等，發(fā)生次數(shù)越多，過敏反應越嚴重。IgE是血漿在過敏時釋放的特性性過敏原，主要由血漿細胞釋放，是一種特異性抗體[3]。尋找過敏源，是治療過敏的主要任務，也是對過敏性疾病診斷的關(guān)鍵，因此，特異性IgE檢測，對過敏患者的治療和預防意義重大[4]。目前，臨床上主要使用的診斷方法有兩種，即體內(nèi)試驗和體外試驗。常用方法是皮刺試驗（SPT），但由于SPT結(jié)果主觀性特別強，并且不安全，一些嚴重過敏反應的患者，變態(tài)反應強烈，風險較大，此外針刺痛苦巨大，多數(shù)患者難以忍受[5]。現(xiàn)在除了藥物敏感性試驗很少使用。血清檢測，可用于各種特異性IgE的檢測，定量或半定量都可以。血清檢測，敏感性高，陽性率也非常高，均高于皮膚試驗，并且創(chuàng)傷小，無劇烈的變態(tài)反應，患者接受度高[6]。對于那些更愿意接受患者，尤其是兒童的患者來說這幾乎是無痛。近年來熒光免疫酶法（FEIA）及化學發(fā)光法、免疫印跡法、免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗等方法被廣泛應用于過敏原檢測。前兩種的方法需要特殊設備和試劑[7]。由于前兩種的方法需要特殊設備和試劑，基于免疫印跡原理酶聯(lián)免疫吸附法和半定量檢測特異性IgE成本很高[8]。價格相對較低且不僅可以滿足臨床需求，并且還可以降低患者的經(jīng)濟負擔，已經(jīng)被廣泛的應用于臨床。本文對臨床上比較常用的檢測方法進行比較，比較臨床常用兩種方法[9]。兩種方法的共同特點為操作都非常簡單，并且酶聯(lián)免疫吸附法耗時比較少，免疫印跡法的耗時比較長。但是兩種檢測結(jié)果，與其他檢測結(jié)果區(qū)別非常大[10]。這兩種方法所用抗原成分復雜性的可能是不同的。肉印跡法以牛肉的為主，酶聯(lián)免疫吸附測定法以多種肉的為抗原，二者有很大差異，其他過敏原符合率較高[11]。應該指出用于在檢測食品過敏原有一個重大的問題，就是大多數(shù)被檢測出的抗原都是未加工的食品提取物或者一些在食品的加工過程中可以引起過敏的物質(zhì)，這就導致一些過敏原不容易被篩查出[12]。免疫印跡法源至德國，采用德國MediwisswC公司生產(chǎn)Allery系統(tǒng)，對過敏原進行篩查。系統(tǒng)將過敏原集中在一起，并且并沒有修改。采用生物素-親和素，對硝酸纖維素膜上的微量IgE進行放大[13]，該系統(tǒng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并且較為便宜，不需要昂貴的儀器。在臨床上應用比較廣泛。目前，臨床上較為常規(guī)使用的壓印檢測的系統(tǒng)多數(shù)為進口產(chǎn)品，并且價錢比較昂貴，與國內(nèi)壓印檢測的系統(tǒng)有相同過敏反應。進口系統(tǒng)原抗決定因素不一致并不符合中國人群過敏原譜，檢測患者對不能接觸過敏原敏感性，對臨床指導意義并不大，而且增加了患者負擔，這值得臨床考慮。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）也是近年來臨床應用一種方法，目前已成為國內(nèi)主要試劑。方法采用生物素-抗生素-蛋白擴增法來提高特異性IgE檢測靈敏度。它既簡單又便宜且，研究發(fā)現(xiàn)，中國是抗原唯一的來源地。因此這項檢測方法更加適合中國人，尤其是在沒有特殊設備檢驗的情況下。酶聯(lián)免疫吸附試驗主要受交叉反應影響，交叉反應可以導致假陽性。這種方法是獨一無二的，尤其是在缺乏國際統(tǒng)一標準的特異性的IgE抗體情況下。因此在檢測過程中要格外注意不同方法的差異和相關(guān)性。在臨床上，選擇合適的檢測過敏原的方法對預防和治療的過敏性疾病具有重要意義。血清中變應原特異性的IgE水平表達比較單一，只能檢測被測試的過敏原敏感性。對于過敏原的篩查，主要依靠血清中的過敏原特異性IgE水平，臨床病史也是一個準確地診斷過敏原的方法。筆者研究發(fā)現(xiàn)兩種方法測定在家塵和肉制品這兩樣過敏原中有差異，差異具有臨床統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其他指標無差異。

綜上所述，免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法在檢測過敏原的時候，各有優(yōu)缺點，但是目前沒有過敏原國際標準，并且缺乏特異性的IgE抗體，并且不同檢測方法在結(jié)果上不相同，因此應該注意不同方法之間的相關(guān)性。