茶葉中EGCG改善肥胖大鼠腸黏膜屏障損傷的作用研究

劉振云，左高隆,2，林 勇,2,3*

1. 湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128；3. 湖南省植物功能成分利用協同創新中心，湖南 長沙 410128

肥胖是一種全球性的健康問題。據報道，全球有約2.5億人的生活受肥胖影響，其已被確定為全球第五大死亡危險因素[1]。肥胖的發病原因十分復雜，主要包括飲食失衡、運動匱乏、遺傳和腸道屏障損傷等因素[1]。其中，高熱量食物的攝入容易改變腸道菌群組成，導致宿主從飲食中獲取更多能量從而增加體重[2]。此外，高脂食物的攝入還會增加腸道通透性并促進內毒素易位，引起機體慢性低度炎癥和氧化損傷[3]，“腸-脂肪”信號軸已成為防治肥胖的潛在靶點[4]。但是，當前針對肥胖癥的安全高效藥物十分緊缺，尋求能防治肥胖的植物資源及有效成分已逐漸成為科學家們研究的熱點。茶是藥食兼用的植物資源，大量研究表明茶葉具有降脂減肥、調節腸道菌群、修復腸粘膜機械損傷、維持腸道穩態等多種功效[5-6]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）作為綠茶的主要活性單體成分，為茶葉諸多藥理功能之首要成分[7]。先前的研究表明，EGCG能夠通過激活AMPK信號通路以及調節脂肪代謝基因表達來降低體重和抑制脂肪蓄積[8-9]；此外，EGCG還可以通過改變高脂飲食小鼠腸道菌群組成達到降低體重的目的[10]。我們以前的實驗結果也表明，EGCG對高脂飲食大鼠具有明顯的調脂保肝作用[11]。然而，EGCG對肥胖大鼠的腸道屏障損傷的保護作用未見報道，相關降脂減肥的潛在機制也尚未完全闡明。基于此，本文從“腸-脂肪”信號軸角度，通過體重、臟器指數、脂肪和腸道病理情況、炎癥因子、內毒素水平等指標分析，探究EGCG對肥胖大鼠腸黏膜屏障損傷的改善作用并闡釋相關降脂減肥的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 EGCG樣品

購自sigma公司，純度≥98%。

1.1.2 試驗動物及飼料

Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，體質量為（100±20）g，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。高脂飼料的配制參照《保健食品檢驗與評價技術規范 輔助降血脂功能評價方法》（2012年修訂），配方為基礎飼料63.6%、蔗糖20.0%、豬油15.0%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試劑

總膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-c）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-c）、谷丙轉 氨 酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（Aspartate transaminase，AST）及二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）和脂多糖（LPS）Elisa測定試劑盒購于卡邁舒（上海）生物科技有限公司。

1.2.2 儀器

MIKRO 22R冷凍離心機（德國Hettich公司）、Modulyod-230冷凍干燥機（美國Thermo公司）、Thermo Scientific Varioskan Flash酶標儀（美國Thermo公司）、UV-2550紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）、AEU-210湘儀電子天平（長沙湘儀天平儀器公司）、Allegra X-22R臺式離心機（美國貝克曼公司）、移液槍（美國Thermo公司）、壓力蒸汽滅菌鍋（上海中安醫療器械廠）、病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）、石蠟包埋機（武漢俊杰電子有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的構建和給藥標準

根據已有研究[11]，建立動物模型并確定給藥標準。取體質量為（100±10）g的SPF級雄性SD大鼠，在溫度（25±2）℃和濕度40% ～60%的環境中，提供基礎飼料和飲用水供大鼠自由飲食。經過一周適應性飼養后，將大鼠隨機平均分為4組（n = 8）：正常組、肥胖組、EGCG低劑量組（75 mg/kg）和EGCG高劑量組（150 mg/kg）。每日上午9時對EGCG組大鼠灌胃不同劑量的EGCG溶液，均用蒸餾水配置2 mL，正常組和肥胖組大鼠灌胃相同體積的蒸餾水。其中正常組大鼠喂食基礎飼料，其余組大鼠喂食高脂飼料，共持續56 d。每7 d稱取一次大鼠體重。最后一次灌胃后禁食不禁水24 h，將大鼠麻醉，主動脈取血，解剖收集附睪脂肪組織、空腸和結腸，迅速稱重后于-80℃保存。

1.3.2 血清指標的測定

主動脈取血后，放入EP管中，在4℃靜置2 h后，于4℃下3500 r·min-1離心15 min，取上清液。嚴格按照試劑盒說明書操作步驟檢測血 清 TG、TC、HDL-c、LDL-c、ALT、AST、LPS、DAO和TNF-α含量。

1.3.3 器官指數測定

將大鼠各器官用4℃生理鹽水洗凈血漬，濾紙吸干表面水分后稱其濕重。器官指數=器官濕質量（g）/大鼠體質量（g）×100%。

1.3.4 大鼠組織病理學觀察

大鼠肝臟、脂肪和腸道病理切片制備：分別取每只大鼠肝臟、附睪脂肪、空腸和結腸組織的相同部位，在10%福爾馬林液下固定，固定后經流水沖洗數小時。制備石蠟切片，H&E染色，顯微鏡下拍照觀察。

1.3.5 大鼠空腸絨毛長度、隱窩深度和上皮間淋巴細胞數量測定

利用Caseviewer圖像分析軟件對大鼠的空腸絨毛高度和隱窩深度進行測定。每組隨機選取4只大鼠的空腸H&E染色切片，每張切片選取2根形態結構完整的絨毛，計算絨毛長度/隱窩深度（Villus height/Crypt depth，V/C）的比值；統計絨毛上每100個空腸細胞間分布的上皮間淋巴細胞數量。

1.4 數據處理

采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行方差分析，統計結果以平均數±標準差（±s）表示。*P < 0.05表示存在顯著性差異，**P < 0.01表示存在極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 對肥胖癥大鼠體重的影響

表1可看出，與正常組相比，肥胖組大鼠從第二周開始體重明顯增加（P < 0.05或P <0.01）。與肥胖組相比，EGCG低、高劑量組大鼠從第三周開始體重均明顯降低（P < 0.05或P< 0.01）。結果表明高脂飲食可以顯著增加大鼠體重，而給藥EGCG后可有效降低大鼠體重。

表1 EGCG對大鼠體重影響（n = 8）Table 1 Effect of EGCG on body weight of rats (n=8)

2.2 對肥胖癥大鼠血脂代謝的影響

由表2可知，與正常組相比，肥胖組大鼠的血清TG、TC和LDL均顯著增加，HDL顯著降低（P < 0.01）。給藥低劑量和高劑量EGCG后，肥胖大鼠的血清TG、TC和LDL水平均顯著降低，HDL水平顯著增加（P < 0.01），呈劑量依賴關系。表明高脂飲食會導致大鼠血脂代謝紊亂，而給藥EGCG可有效改善高脂誘導的血脂代謝紊亂現象。

表2 EGCG對大鼠血清指標的影響（n = 8） （mmol/L）Table 2 Effect of EGCG on serum indexes of rats (n=8) （mmol/L）

2.3 對肥胖癥大鼠體脂率和脂肪細胞的影響

圖1A表明，與正常組相比，肥胖組大鼠的體脂率顯著增加（P < 0.01）；與肥胖組相比，給藥低、高劑量EGCG均能顯著降低肥胖大鼠的體脂率（P < 0.01），并呈劑量依賴關系。此外，附睪脂肪組織H&E染色結果表明（圖1B），正常組大鼠脂肪細胞排列規則，尺寸較小，無病理特征；肥胖組大鼠的脂肪細胞存在較嚴重的病變（炎細胞浸潤現象如黑色箭頭所示），且脂肪細胞腫大；給藥EGCG后均能顯著改善脂肪細胞病變現象并能夠減少脂肪細胞尺寸。這些結果表明，高脂飲食會增加大鼠體脂率和脂肪細胞大小，并引起脂肪組織病變，而給藥EGCG可有效降低肥胖大鼠體脂率和脂肪細胞大小，改善脂肪病變。

圖1 EGCG對肥胖大鼠脂肪蓄積及炎癥的影響（n = 8）Figure 1 Effects of EGCG on fat accumulation and inflammation in obese rats (n=8)

2.4 對肥胖癥大鼠腸道通透性及炎癥的影響

表3表明，與正常組大鼠相比，肥胖組大鼠血清LPS、DAO、TNF-α含量和空腸上皮間淋巴細胞數量均顯著增加（P< 0.01）；在給藥低、高劑量EGCG后，肥胖組大鼠血清LPS、DAO、TNF-α含量和空腸上皮間淋巴細胞數量均顯著減少（P< 0.01），且呈劑量依賴關系。這些表明，高脂飲食會破壞腸道通透性，增加炎癥狀況，而給藥EGCG可以減少腸道通透性，抑制炎癥。

表3 EGCG對大鼠腸道通透性及炎癥的影響（n = 8）Table 3 Effects of EGCG on intestinal permeability and inflammation of rats (n=8)

2.5 對肥胖癥大鼠腸道病理損傷的影響

腸道H&E染色切片結果（圖2和表4）表明，正常組大鼠空腸和結腸絨毛排列整齊、完整，無病理損傷現象；肥胖組大鼠空腸絨毛排列稀疏、斷裂，有明顯的炎細胞浸潤現象且空腸V/C值較正常組顯著降低（P< 0.01），結腸有水腫現象（如黑色箭頭所示）；EGCG給藥組大鼠空腸絨毛排列緊密、整齊，無斷裂，空腸未產生炎細胞浸潤現象且空腸V/C值較肥胖組大鼠顯著增加（P< 0.01），結腸無水腫現象。這些表明，高脂飲食會增加破壞腸道穩態，造成腸道絨毛損傷，誘發炎癥，增加腸道水腫，而給藥EGCG可以有效保護高脂飲食引起的腸道穩態失衡，抑制炎癥。

表4 EGCG對大鼠空腸絨毛的影響（n = 8）Table 4 Effect of EGCG on Jejunum villus in rats (n=8)

圖2 EGCG對大鼠腸道病理損傷的影響（n = 8）Figure 2 Effect of EGCG on intestinal pathological injury in rats (n=8)

3 結論與討論

由能量攝入和能量消耗失衡而導致的肥胖日益成為全球范圍內主要的健康問題。然而，針對肥胖癥的改善措施除生活方式的調整外，僅有少許藥物如奧利司他等用于肥胖癥的治療[12]，但會引起腹瀉、頭痛和過敏等諸多不良副作用。因此，尋求和探明能防治肥胖的植物資源的天然活性成分以及相關作用機制逐漸成為科學家們研究的熱點。基于此，本實驗從“腸-脂肪”信號軸及腸道屏障的角度探究茶葉中EGCG對肥胖癥大鼠腸道屏障損傷的保護作用以及降脂減肥的相關機制。

本實驗結果發現，灌胃EGCG可以有效降低高脂引起的大鼠體重增加，并與我們先前的研究結果一致[11]；EGCG也可明顯降低體脂率并減少脂肪細胞大小。EGCG降低體重與其改善葡萄糖耐量及脂質代謝紊亂有關[13]。最新的研究表明，EGCG的這一作用歸因于其通過調節Beclin1自噬促進脂肪組織脂質分解發揮作用[14]。

LPS是由革蘭氏陰性細菌產生的，在腸道屏障功能損傷后，其通過MYD88/TLR4通路進入體循環并引發機體免疫反應，嚴重時可引發內毒素血癥[15]。DAO由小腸粘膜產生，在腸道屏障損傷后會大量進入血液，已成為評價腸道屏障功能的常見指標[16]。我們研究發現，EGCG可有效降低血清中LPS、DAO和TNF-α含量，并減少空腸上皮間淋巴細胞數量來抑制腸道炎癥，與本實驗中脂肪組織病理學切片中的炎癥現象減弱一致。這可能與EGCG抑制高脂飲食宿主腸道有害細菌生長，減少LPS的產生從而抑制炎癥有關[17]。先前的研究表明，EGCG可抑制肝臟TLR4表達來減輕肝臟炎癥[18]，我們推測EGCG在腸道TLR4通路中可能也發揮類似的作用從而減少LPS的轉運。腸道絨毛被破壞后，內毒素會更容易進入細胞激活炎癥級聯信號造成機體損傷，且機體能量吸收會嚴重失衡[19]。我們發現給藥EGCG可以有效保護肥胖癥大鼠的腸道絨毛完整性，增加V/C值，減少腸道炎癥和水腫現象。

綜上，茶葉中EGCG可降低大鼠體重，減少脂肪蓄積及炎癥現象，從而有效改善大鼠肥胖癥狀；同時有效保護腸道屏障完整性及功能，減少LPS進入體循環，降低血清炎癥因子水平。本實驗結果提示了EGCG對高脂飲食誘導的肥胖大鼠腸道屏障的保護作用，調節“腸-脂肪”信號軸，這可能也是其改善肥胖大鼠脂肪聚集及相關炎癥的作用機制。