茶葉抗癌作用機制的網絡藥理學分析

吳雨泉，杜紫微，李佳珍，王一碩,2*，石延榜,2

1.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南省中藥生產一體化工程技術研究中心，河南 鄭州 450046

克服癌癥是人類面臨的難題之一。據美國癌癥研究協(xié)會（AACR）發(fā)布的2017年癌癥進展報告指出[1]，至2035年全球每年癌癥新發(fā)病例數(shù)可能增加至2400萬例，這將給人們的生命健康及社會的經濟負擔帶來嚴重的威脅。然而，有學者認為植物化學物對多種癌癥有預防作用[2]，尚可通過日常飲食予以攝入。

中國茶文化歷史悠久，品種眾多，其養(yǎng)生保健作用深受廣大消費者的喜愛。茶的藥用價值最早記載于《神農本草經》，素有“神農嘗百草，日遇七十二毒，得荼而解之”之說。目前，茶葉已涉及食品、藥品和保健品等多個領域?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中主要富有茶多酚類[3]、生物堿[4]和氨基酸類等[5]化學成分。盡管茶葉對癌癥的防治具有潛在的積極作用[6-8]，但涉及的潛在分子機制仍然不明晰。基于此，本文通過生物信息技術、多向藥理學及網絡分析等融為一體的網絡藥理學方法[9]，對茶葉中主要化學成分進行抗癌作用先驗性探究，以期為揭示茶葉抗癌的科學內涵提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 茶葉成分與靶標的收集

通過知網文獻，搜集茶葉中主要的化學成分；把所收集到的成分在化源網（www.chemsrc. com）數(shù)據庫中確定其結構式，并使用Chembiodraw 軟件手動畫取，保存為“CDX”格式；將所有的化學結構式導入SwissTarget Prediction（www.sib.swiss）數(shù)據庫，預測其作用靶點。

1.2 茶葉成分-靶點的網絡構建與拓撲學分析

將上述獲得的成分與靶點導入 Cytoscape 3.7.2軟件，構建活性成分-靶點網絡；利用“Analysis network”工具對該網絡進行拓撲分析，以Degree值表示重要節(jié)點，其值越大，表明在網絡中越重要。

1.3 茶葉成分-疾病的交集靶點分析

以“Cancer”為關鍵詞，在Genecards和DrugBank 兩個數(shù)據庫中檢索癌癥的疾病靶點。其中，Genecards數(shù)據庫的檢索結果通過多次篩選“Relevance score”值的中位數(shù)，以獲得相關度高的靶點信息。將兩個數(shù)據庫所搜集的信息合并，刪除重復項后保存；再將成分靶點與疾病靶點導入Venn（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn）獲得交集靶點。

1.4 PPI網絡的構建與核心靶點篩選

通過String數(shù)據庫（https://string-db.org）分析互作靶點。將物種選擇“人類”并隱藏游離節(jié)點，其他參數(shù)保持默認值，構建PPI網絡；利用Cytoscape 3.7.2 軟件中進行可視化分析，并根據Degree值的中位數(shù)篩選核心靶點。

1.5 GO與KEGG富集分析

將[1.4]獲得的核心靶點導入Metascape數(shù)據庫（https://Metascape.org），物種選擇“人類”，對其進行GO生物功能富集分析，包括生物過程（Biological process，BP）、細胞組成（Cell composition，CC）和分子功能（Molecular function，MF）；KEGG通路富集分析使用同一數(shù)據庫。

2 結果與分析

2.1 茶葉成分與靶標的收集結果

通過文獻研究[4,10-12]，最終納入兒茶素（Catechin）、表兒茶素（Epicatechin）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate）、兒茶素沒食子酸酯（Catechin gallate）、咖啡堿（Theobromine）、蘆?。≧utin）、天門冬氨酸（Aspartic acid）、精氨酸（Argininic acid）、谷氨酸（L-glutamic acid）、茶氨酸（L-Theanine）和茶黃素（Theaflavin）共13種化學成分；將各成分的化學結構式導入 SwissTargetPrediction數(shù)據庫中，共計得到391個靶點，去重整合后最終得到165個靶點。

2.2 茶葉成分-靶點網絡的構建與拓撲分析學結果

將[2.1]收集到的成分和靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建茶葉成分-靶點絡。圖1顯示，該網絡由178個節(jié)點（13個成分，165個靶點）和391條邊組成。圖中綠色八邊形表示納入茶葉的主要成分，藍色菱形為靶點。使用“Analysis network”對該網絡進行拓撲學分析，進而獲得Degree、BetweennessCentrality、ClosenessCentrality等多個參數(shù)值；其圖形大小與顏色深淺與Degre值成正相關；Degree中位數(shù)為1，BetweennessCentrality中位數(shù)為0，ClosenessCentrality中 位 數(shù) 為0.268 404 91。Degree大于兩倍中位數(shù)（≥2）的有80個節(jié)點，占44.9%。根據Degree值大小，排名前三位的成分有 Epicatechin gallate、Catechin gallate、Gallocatechin gallate 和 Epigallocatechin gallate；排名前三位的靶點有CA12、CA1、CA2、PTGS1，提示這些成分和靶點可能與癌癥密切相關。網絡拓撲基本信息見表1。

圖1 茶葉13種化學成分-靶點的網絡構建Figure 1 Network construction of 13 chemical components-targets in tea

表1 茶葉成分-靶點網絡中關鍵節(jié)點的網絡拓撲信息Table 1 Network topology information of key nodes in tea composition-target network

2.3 茶葉成分-疾病的交集靶點結果

以“Cancer”為關鍵詞，在DrugBank數(shù)據庫中查詢得到58個靶點；同時在 Genecards數(shù)據庫中查詢得到候選靶點25 460個，通過“Relevance score”取三次中位數(shù)（n≥7.06）篩選得到3327個相關疾病靶點。將兩個數(shù)據庫得到的結果歸一整合，共得到3350個疾病靶點；Venn圖顯示，藥物與疾病的交集靶點共79個，提示這些靶點可能是茶葉治療癌癥的潛在靶點（圖2）。

圖2 茶葉成分-疾病交集靶點的Venn圖Figure 2 Venn diagram of tea composition-disease intersection target

2.4 PPI網絡構建及核心靶點篩選

將79個關鍵靶點導入String生物分析平臺，物種選擇為“人類”，分析其互作關系。網絡顯示共有79個節(jié)點683條邊（超過預期值208），平均每個節(jié)點的Dgree值為17.3；有5個游離節(jié)點，將游離節(jié)點隱藏后導入Cytoscape 3.7.2軟件，并根據 Degree 中位數(shù)（n≥14）選取核心靶點，結果如圖3所示。圖中顯示共有40個節(jié)點440條邊，節(jié)點的大小和顏色的深淺與Degree值成正相關，邊的粗細代表Combine score值的大小，邊越粗值越大。Degree值排名前十位的核心靶點有IL6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1，提示這些靶點可能是茶葉治療癌癥的核心靶點。

圖3 核心靶點的PPI 網絡Figure 3 PPI network of core target

2.5 茶葉成分-疾病靶點的GO及KEGG富集分析

2.5.1 茶葉成分-疾病靶點的GO富集分析

將[2.4]項下的40個核心靶點導入Metascape數(shù)據庫，物種選擇為“人類”，共確定4540個GO條目（P< 0.01），其中BP有3739個條目，涉及積極調控細胞遷移（positive regulation of cell migration）、調節(jié)平滑肌細胞增殖（regulation of smooth muscle cell proliferation）、對氧氣水平的反應（response to oxygen levels）和白細胞分化（leukocyte differentiation）等；CC共有393個條目，涉及膜筏（membrane raft）、細胞質核周區(qū)域（perinuclear region of cytoplasm）、轉錄因子復合體（transcription factor complex）和 粘 附 連 接（adherens junction） 等；MF有408個條目，涉及細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、內肽酶活性（endopeptidase activity）、蛋白磷酸酶結合（protein phosphatase binding）和一氧化氮合酶調節(jié)劑活性（nitric-oxide synthase regulator activity）等。如圖4所示，校正P值前十位條目的標準分數(shù)（z-score)。

圖4 茶葉成分-靶點的GO富集分析Figure 4 GO enrichment analysis of tea components-targets

2.5.2 茶葉成分-疾病靶點的KEGG信號通路富集分析

將[2.4]項下的40個核心靶點導入Metascape數(shù)據庫，物種選擇為“人類”，進行KEGG信號通路功能富集分析，最終共確定353個條目（P< 0.01），根據校正后P值的大小取前20位通路，見圖5氣泡圖。結果顯示，主要涉及癌癥的途徑（Pathways in cancer）、癌癥中蛋白聚糖（Proteoglycans in cancer）、小細胞肺癌（Small cell lung cancer）、癌癥中的轉錄失調（Transcriptional misregulation in cancer）和前列腺癌（Prostate cancer）等。以上結果表明，茶葉中13種化學成分與抗癌作用密切相關，基本信息見表2。

表2 茶葉成分-疾病靶點的前20位KEGG信號通路富集結果Table 2 Enrichment results of the top 20 KEGG signaling pathways of tea components-disease targets

圖5 茶葉成分-疾病靶點的KEGG信號通路富集分析氣泡圖Figure 5 Bubble chart of enrichment analysis of KEGG signaling pathway of tea components-disease targets

2.6 茶葉成分-靶點-通路的網絡構建

綜合上述分析得到的成分-靶點-通路結果，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建“成分-靶點-通路”的網絡關系圖。由圖6所示，涉及茶葉參與癌癥調控的成分有11個，由紅色圓形所示；靶點31個，由黃色圓形所示；綠色圓形表示為通路，其圖形面積大小和顏色深淺與Degree值成正相關。其中，Aspartic acid與L-glutamic acid無對應靶點和通路。排名前十位的靶點有VEGFA、MAPK14、MMP2、MMP9、EGFR、IL6、CDK2、STAT1、TNF、CASP3、JUN、MET、NOS3和CREB1，提示這些靶點可能是茶葉治療癌癥的重要靶點。

圖6 茶葉成分-靶點-通路的網絡構建Figure 6 Network construction of tea components-targets-pathways

3 討論與結論

近年來，隨著我國醫(yī)療技術蓬勃發(fā)展，癌癥的治療手段也邁進了全新時代。分子靶向治療與生物免疫治療等現(xiàn)代化治療技術在臨床得到日益廣泛的應用[13]。然而，生活習慣、工作環(huán)境、遺傳與衰老等可能是誘發(fā)機體組織癌變的主要因素[14-16]，因此抗癌重在預防。中醫(yī)素有“藥食同源”之說，認為食療的綜合調攝是防治癌癥的重要方式[17]。而茶葉因其獨特的功效與滋味，最終被確定為一種可長期飲服的飲料[18]。唐代《本草拾遺》[19]記載：“諸藥為各病之藥，茶為萬病之藥。”現(xiàn)代研究表明，茶葉具有顯著的抗癌作用[6-8]。本文通過文獻調研[4,10-12]，最終納入茶葉中13種主要成分進行網絡藥理學研究，為進一步探究茶葉抗癌的科學內涵以及茶葉的二次開發(fā)提供新思路。

3.1 茶葉“成分-靶點”抗癌作用

網絡藥理學研究結果表明，13種茶葉化學成分涉及165個靶點；合并DrugBank和Genecards數(shù)據庫共收集癌癥相關靶點3350個，其成分與疾病的交集靶點有79個；PPI網絡確認IL6、VEGFA和TNF等40個核心靶點。

依據表1成分-靶點的網絡拓撲結果分析，Dgree值排名前三位的成分分別是Epicatechin gallate、Catechin gallate、Gallocatechin gallate 和Epigallocatechin gallate，同屬茶多酚類化合物。

Epigallocatechin gallate是茶葉中含量最豐富的茶多酚類成分，約占兒茶素總量的50%～80%[20]。在癌癥的調控氧化應激、阻滯腫瘤細胞周期、抑制腫瘤血管生成和誘導癌細胞凋亡等分子機制方面發(fā)揮著重要作用[21]。CASP3是Caspase家族中介導細胞凋亡的關鍵執(zhí)行分子，馮強[22]認為綠茶提取物Epigallocatechin gallate可能是MCF-7細胞中Caspase3蛋白活性增強的主要因素，對乳腺癌細胞有一定的抑制作用；Chen[23]課題組研究發(fā)現(xiàn)，Epigallocatechin gallate處理可致腎細胞癌細胞中MMP-2（基質金屬蛋白酶2）和MMP-9（基質金屬蛋白酶9）的下調，表明具有一定的抗癌作用；另有學者發(fā)現(xiàn)[24]該成分可抑制肝癌細胞增殖及誘導細胞凋亡, 其機制可能與TNF-α（腫瘤壞死因子-α）等炎癥信號分子表達的變化有關。

Epicatechin gallate屬黃烷醇類化合物。Kürbitz C 研究發(fā)現(xiàn)[25]，Epicatechin gallate和Catechin gallate對人胰管腺癌細胞的抑制效果比Epigallocatechin gallate強，尤其是Epicatechin gallate可抑制TNF-α誘導的NF-κB活化，并因此分泌促炎和侵襲促進蛋白；從成分的安全性角度來看，Epicatechin gallate可誘導人口腔癌細胞的凋亡，但對正常的細胞無明顯影響[26]，表明該化合物對癌癥的治療安全有效。

此外，還存在一些Degree相對值不高但對癌癥細胞有抑制作用的成分。在Theobromine與L-Theanine兩種成分對二甲基肼誘導的結腸癌抑制作用的研究中發(fā)現(xiàn)[27]，兩種成分單獨或組合使用均通過下調Akt / mTOR和JAK2 /STAT3途徑以及增加Smad 2腫瘤抑制因子來抑制腫瘤發(fā)生，其中組合使用時治療作用更顯著。Theaflavin是一類具有苯駢卓酚酮環(huán)結構的天然化合物。Tan[28]研究表明，Theaflavin通過誘導細胞周期停滯，對人結腸癌SW480和SW620細胞的增殖具有抑制作用，但對正常細胞的毒性較低，提示安全指數(shù)較高。

3.2 茶葉抗癌的核心靶點與作用機制

根據[2.4]項下PPI提取的核心靶點，獲得排名前十位的靶點有IL6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1，其中IL-6、TNF與CCL2屬于炎癥因子，它們都與免疫炎癥及組織壞死相關；在[2.5.2]項下KEGG通路分析顯示，茶葉涉及多種癌癥的相關通路、PI3K-Akt信號通路和NF-κB等信號通路，這些通路與炎癥浸潤和氧化應激有關。

IL6（白細胞介素6）作用的靶細胞很多，包括巨噬細胞、肝細胞、靜止的T細胞、活化的B細胞和漿細胞等。Weber R表示[29]IL-6是骨髓來源的抑制性細胞在腫瘤發(fā)展中產生、積累和激活以及刺激腫瘤細胞增殖與存活及侵襲性與轉移的重要因素。因此，IL-6可作為癌癥的陰性預后標志物；EGFR（表皮生長因子受體）是HER家族成員之一，參與細胞增殖、分裂和周期調控等過程。茶氨酸及其衍生物可減少EGFR、MET、Akt和子宮頸癌細胞中的NF-κB，在人類宮頸癌中可能具有治療或輔助治療應用的潛力[30]；VEGFA（血管內皮生長因子）可誘導腫瘤等組織的血管生長，維持腫瘤的生長。VEGFA可激活PI3K[31]，而PI3K參與內皮細胞微管的形成，也參與內皮細胞增殖、存活、遷移和血管通透性的形成[32]；TNF多由激活的巨噬細胞和免疫細胞（B細胞和T細胞）等產生[33]。前列腺癌組織中存在高表達的TNF-α。此外，TNF-α可刺激生物體產生損傷細胞DNA的分子產物, 從而加速前列腺癌的發(fā)展[34-35]；PTGS2（前列腺素內過氧化物合酶2）是一種已被廣泛研究作為癌癥預后標志物的酶。PTGS2位于TGFβ的EPHA2信號傳導的下游，PTGS2缺失可逆轉T細胞排斥反應，并使腫瘤對免疫治療敏感[36]；ESR1（雌激素受體1）的配體結合域中的體細胞突變是乳腺癌發(fā)展的關鍵介質。胰島素樣生長因子-1（IGF1）是乳腺發(fā)育和腫瘤發(fā)生的重要調節(jié)劑，而PI3K-Akt軸是介導ESR1突變細胞中增強的IGF1反應的主要途徑[37]；MMP9（基質金屬蛋白酶9）屬于基質金屬肽酶家族成員，它是一類復雜的內肽酶。Tsai等[38]研究表明NF-κB信號通路下游腫瘤進展相關MMP9與肝癌病灶生長、血管生成和轉移密切相關，NF-κB信號通路抑制可顯著降低其表達；JUN是一種原癌基因蛋白。Jun和Fos蛋白組成的AP-1因子可以調節(jié)生物學行為的基因表達，從而調節(jié)腫瘤細胞的侵襲性生長、腫瘤血管生成以及腫瘤轉移[39]；CCL2（趨化因子配體2）是一類在炎癥和病理條件下引導粒細胞遷移運動的可溶性蛋白分子，可調節(jié)單核細胞的浸潤和遷移，在腫瘤和基質細胞中均高表達，并與腫瘤發(fā)生密切相關[40]；CREB1（cAMP反應元件結合蛋白1）是真核細胞中重要的轉錄調節(jié)因子?；罨腃REB參與多種信號傳導過程, 調控細胞的增殖、分化、凋亡及能量代謝，同多種腫瘤的生長及血管形成有關，能夠介導細胞增殖并誘導細胞抗凋亡模式形成[41]。因此，CREB是一個重要的潛在抗腫瘤藥物作用靶點。

綜上，茶葉抗癌潛在的活性成分可能通過L6、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、ESR1、MMP9、JUN、CCL2和CREB1介導癌癥的相關通路、PI3K-Akt信號通路與NF-κB等信號通路，參與炎癥反應與氧化應激等過程達到防治癌癥的目的。本文通過網絡藥理學的方法探究茶葉潛在的抗癌成分、靶點及作用機制，結合圖1和表2，發(fā)現(xiàn)茶多酚類可能是抗癌作用的主要成分，多成分多靶點的綜合調控是茶葉發(fā)揮藥效物質基礎的優(yōu)勢所在。本文僅在理論水平上進行探討，雖然部分能與以往的研究對應，但還存在一定的發(fā)掘空間，期望不久的將來隨著科學技術的發(fā)展，在實驗水平上能夠揭示更多的科學內涵。