HPLC法測定市售白酒中的甲醛含量

胡 楊，李先芝，2，劉 洋，林 露，石 豪，毛瓊麗，嚴 玲

（1.勁牌有限公司，湖北大冶 435112；2.中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點實驗室，湖北大冶 435112）

甲醛是一種具有刺激性氣味的細胞原生質(zhì)毒物，作為一種代謝成分普遍存在于生物體中，通過破壞生物體中的蛋白質(zhì)和酶，使得組織細胞產(chǎn)生不可逆的損傷。早有研究發(fā)現(xiàn)，長期處于甲醛環(huán)境中會對人體機能造成影響，比如嘔吐、腹痛、誘發(fā)哮喘[1]、急性炎癥[2]、呼吸道損傷[3]、白血病[4]等。因此，甲醛被世界衛(wèi)生組織確定為致癌和致畸物質(zhì)[5]，同時歐洲食品安全管理局（EFSA）建議經(jīng)口攝入甲醛每天不得超過11 mg/kg[6]。雖然我國頒布的《食品衛(wèi)生法》中明文規(guī)定禁止向食品中添加甲醛，但由于甲醛在防腐保鮮[7]、殺菌消毒[8]、增白等方面具有顯著效果，一些不法商人將甲醛加入食品中，以達到提高食品亮澤度、延長保存期、改善口感等目的。

目前，有關食品中甲醛含量檢測主要集中在肉制品[9]、水產(chǎn)品[10]、啤酒[11]等領域，對白酒中甲醛含量檢測的研究較少。甲醛檢測主要有分光光度法[12-13]、熒光

法[14-15]、色譜法[16]等。其中高效液相色譜法因具有靈敏度高、準確度好、干擾小、操作簡單等特點被廣泛運用于各行業(yè)中的甲醛含量檢測[17]。因此，本研究在此基礎上開發(fā)建立一種白酒中甲醛含量檢測方法，以期為我國白酒中甲醛含量檢測及食品安全提供科學有效的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 材料與試劑

樣品：不同品牌市售白酒。

試劑及耗材：甲醛標準溶液(100 μg/mL，北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術有限責任公司)；甲醇、乙腈（HPLC 級，美國Fisher 公司）；2,4-二硝基苯肼（HPLC 級，美國Sigma 公司）；乙酸鈉、乙酸（分析級，國藥集團有限公司）；水為超純水。

1.1.2 儀器設備

高效液相色譜儀（賽默飛公司，UltiMate 3000，美國），電子分析天平（賽多利斯SQP，德國），數(shù)控超聲波清洗儀（上?？茖С晝x器有限公司，中國），PURELAB-超純水儀（PURELAB classic UV，英國），數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司，中國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

2,4-二硝基苯肼溶液：精密稱取2,4-二硝基苯肼適量至容量瓶中，用乙腈溶解并定容，制備成濃度為1.5 mg/mL的2,4-二硝基苯肼的溶液。

乙酸鈉緩沖液：準確稱取2.64 g 乙酸鈉，用超純水溶于500 mL 的容量瓶中，用乙酸調(diào)節(jié)pH 值至5。

衍生液：將2,4-二硝基苯肼溶液和乙酸鈉緩沖液按照1∶1（V∶V）混合。

1.2.2 供試品溶液的制備

精確量取白酒樣品0.8 mL 于10 mL 具塞比色管中，加入衍生液至刻度線，搖勻，置于60 ℃水浴中衍生30 min，取出，冷卻至室溫，取適量樣品過0.22 μm有機相濾膜，即得。

1.2.3 色譜條件

色譜柱為Inertsil ODS-3-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇∶水（68∶32，V∶V），柱溫40 ℃，檢測波長360 nm，進樣量20 μL，等度洗脫。

2 結果與分析

2.1 衍生條件的優(yōu)化

2.1.1 衍生時間的確定

為確定最佳的衍生時間，在維持衍生溫度不變的前提下，改變衍生的時間，比較在不同衍生時間下測得衍生產(chǎn)物含量的峰面積，結果如圖1 所示。在60 ℃衍生溫度條件下，隨著衍生時間從15 min到30 min，衍生產(chǎn)物的峰面積呈逐漸增長的趨勢；當衍生時間超過30 min時，衍生產(chǎn)物的峰面積逐漸下降。因此，確定最佳衍生時間為30 min。

圖1 不同衍生時間衍生物峰面積變化曲線

2.1.2 衍生溫度的確定

為確定最佳的衍生溫度，在維持衍生時間不變的前提下，改變衍生溫度，比較在不同衍生溫度下測得衍生產(chǎn)物含量的峰面積，結果如圖2 所示。隨著衍生溫度從40 ℃到60 ℃，衍生物的峰面積逐漸增大；當衍生溫度從60 ℃上升到70 ℃時，衍生物的峰面積開始逐漸減少，說明當溫度較低時，衍生不充分，而溫度過高則會使衍生物不穩(wěn)定。因此，確定最佳衍生溫度為60 ℃。

圖2 不同衍生溫度衍生物峰面積變化曲線

2.2 標準曲線、線性范圍及檢出限

分別精確量取不同體積的甲醛標準溶液，置于10 mL 具塞比色管中，加衍生液至刻度線，混勻，配制成不同濃度的系列標準溶液，將上述標準溶液置于60 ℃水浴中衍生30 min，取出冷卻至室溫。精確吸取不同濃度的標準溶液20 μL，注入液相色譜，按照1.2.3 色譜條件進行檢測，得到各濃度的色譜峰的峰面積，以濃度為橫坐標，相對應的色譜峰面積為縱坐標建立標準曲線，得出線性關系及范圍，見圖3，在0.0125～1.0 mg/L 濃度范圍內(nèi)，線性關系良好，回歸方程為Y=10.544X+0.0648（R2=1.0000）。該方法的檢出限為1.5 μg/mL，能滿足白酒樣品中甲醛含量的檢測。

圖3 甲醛衍生物標準曲線

2.3 精密度實驗

取同一白酒樣品，按照1.2.2 供試品溶液制備方法制備供試品，按1.2.3 色譜條件進行連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，檢測結果見表1。結果顯示，相對標準偏差為0.20 %，表明該方法具有良好的精密度。

表1 精密度實驗結果

2.4 加標回收實驗

取已知含量的同一批次的白酒樣品0.4 mL，共9 份，分別添加不同水平的甲醛標準溶液，按照1.2.2 供試品制備方法進行樣品制備，按照1.2.3 色譜條件進行測定，計算甲醛的回收率及相對標準偏差，結果見表2。由表2 可知，甲醛的加標回收率在93.27%～98.06%之間，相對標準偏差為1.98%，表明本方法準確度高，可以滿足白酒樣品中的甲醛含量檢測。

表2 甲醛加標回收率(n=9)

2.5 樣品檢測

用建立的方法對不同品牌市售白酒中甲醛含量進行檢測，檢測結果見表3。由表3 可知，不同品牌市售白酒中的甲醛含量不同，這可能與其釀造工藝有關。

表3 市售白酒樣品中甲醛檢測結果

3 結論

我國是白酒消費大國，隨著社會的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對酒的品質(zhì)和安全越來越重視。但由于原料及釀造工藝的原因，使得白酒中殘留微量甲醛。本研究建立了高效液相色譜法測定白酒中微量甲醛含量的檢測方法，采用Inertsil ODS-3-C18色譜柱，以甲醇和水為流動相等度洗脫，檢測波長360 nm。實驗結果表明，該方法操作簡單，穩(wěn)定性好，準確度高，能夠很好的運用于白酒中甲醛含量檢測，為白酒中甲醛含量檢測提供參考依據(jù)。