脛骨橫向骨搬移技術對糖尿病兔下肢潰瘍創(chuàng)面促細胞趨化水平的研究

郭國慶 ,陳林海 ,郭明君 ,魏 鵬 ,葉朝輝*

（1.四川省廣漢骨科醫(yī)院骨科，四川 廣漢，618300；2.寧波市第一醫(yī)院整形修復重建外科，浙江 寧波，315000）

中國是世界上糖尿病患病人數(shù)最多的國家，每年約100萬患者新發(fā)糖尿病[1]。糖尿病足部潰瘍是糖尿病患者最嚴重的并發(fā)癥之一，發(fā)生率達14%且84%的下肢截肢與糖尿病有關，已經成為截肢的首要原因[2]。目前糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的治療包括清創(chuàng)、多功能性敷料覆蓋、生物活性制劑應用、截肢、植皮和皮瓣修復等[3]。據國內文獻報道，脛骨橫向骨搬移技術能有效提高創(chuàng)面愈合率，同時能改善下肢的感覺和血運，但機制還未明確[4]。本研究旨在通過設計動物實驗探討脛骨橫向骨搬移技術對糖尿病潰瘍創(chuàng)面促細胞趨化水平的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物與分組

健康的雄性SD級新西蘭白兔32只（購自浙江省醫(yī)學科學院），8月齡，體重2.0～2.5 kg，動物生產許可證號：SCXK（浙）2016-0022。在（24±2）℃的溫控環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進食和水。按照隨機數(shù)字表法將32只新西蘭白兔分成4組：正常兔＋假手術組（A）、正常兔＋脛骨橫向骨搬移治療組(B)、糖尿病兔＋假手術組（C）、糖尿病兔＋脛骨橫向骨搬移治療組(D)，每組各8只。本研究經寧波大學動物倫理委員會批準（2020-286）。

1.2 糖尿病伴下肢缺血性潰瘍模型制備及處理

新西蘭白兔適應性飼養(yǎng)至少1周，給藥前禁食（不禁水）12 h。再用該緩沖液配置10%的左鏈脲佐菌素溶液。在C和D組采取多次小劑量給藥法[5]：經耳緣靜脈按35 mg/kg快速注射新鮮配制溶液，6～8 h注射1次，每次注射前檢測新西蘭白兔血糖值，通過注射胰島素和葡萄糖管理血糖[6]，持續(xù)2周空腹血糖值＞16 mmol/L即表示造模成功。造模成功1周后，手術結扎新西蘭白兔大腿股動脈，同期手術直接切除同側足背1.5 cm×3.5 cm大小的皮膚，創(chuàng)緣向內折疊0.5 cm并固定縫合，術后包扎1周以隔絕新西蘭白兔自噬傷口影響潰瘍形成，1周后形成下肢缺血性潰瘍創(chuàng)面約2 cm×4 cm[7]。正常兔組的創(chuàng)面按照造模后同樣的手術方法執(zhí)行。

1.3 實驗方法

4組新西蘭白兔均使用8%水合氯醛進行全身麻醉，麻醉生效后在脛骨前內側做5 cm弧形切口。（1）設計骨搬移區(qū)域：分別為脛骨上端移行脛骨干區(qū)域和脛骨中段內側嵴的內側面區(qū)域，截取面積分別約0.5 cm×1.0 cm和0.5 cm×0.5 cm，且兩截骨區(qū)域中心之間的距離＞2 cm；（2）剝離骨塊形成可搬移骨扇：首先用0.8 mm的克氏針穿透骨窗中點的單層骨皮質，接著用微型骨刀截斷外側骨皮質，注意切勿過度撬動骨塊，需保持內側骨膜完整，形成可搬移的扇形骨塊；（3）安裝骨搬移支架：在骨窗同一軸線的遠、近2端各轉入2枚直徑2.0 mm的螺紋針固定，中間2枚克氏針與帶刻度的旋轉抬升裝置連接，并校準至刻度0的位置，最后4枚克氏針固定在同一橫桿上并擰緊加固；（4）術后搬移支架：逐層縫合創(chuàng)面，術區(qū)干凈敷料包扎。術后即刻至術后6 d均向外進行骨搬移，通過水平旋轉外接裝置帶動鉸鏈使克氏針上下移動，旋轉1周約1.2 mm，每天旋轉1/4周，約0.3 mm/d；術后7 d開始按同樣的速度搬回骨塊，每3 d攝片觀察搬移情況。假手術組只進行相同的手術切口、組織剝離和骨搬移支架固定。

1.4 觀察指標及檢測方法

術前和術后3、6、9、12 d，分別用干凈的手術刀片切取4組新西蘭白兔創(chuàng)面周圍的新生組織約1 g。將切取的組織使用GM-CSF和TGF‐β1酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司）檢測兔創(chuàng)面新生組織中GM-CSF和TGF‐β1表達水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用Graphpad Prism 7軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間及組內比較采用單因素方差分析或雙因素方差分析。通過計算Spearman相關系數(shù)，比較常規(guī)治療組和脛骨橫向骨搬移治療組在相同時間段同一組織因子水平改變的差異性。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 糖尿病潰瘍創(chuàng)面中GM-CSF 和TGF‐β1 表達水平

A組和C組對照，各時間段GM-CSF,均P＜0.0001（表1）；各時間段TGF‐β1,除外第12天P＞0.05，其他均P＜0.01（表2）。B組和D組對照，各時間段GM-CSF,,除外第12天P＞0.05，其他均P＜0.05（表1）；各時間段TGF‐β1，除外第12天P＞0.05，其他均P＜0.001（表2）。以上結果說明在糖尿病潰瘍創(chuàng)面中，GM-CSF和TGF‐β1表達水平均低于正常創(chuàng)面。

表1 4 組兔子在不同時間段GM-CSF 表達水平的比較(n=8，)

表1 4 組兔子在不同時間段GM-CSF 表達水平的比較(n=8，)

注：A 組：正常兔＋假手術組；B 組：正常兔＋脛骨橫向骨搬移治療組；C 組：糖尿病兔＋結合假手術組；D 組：糖尿病兔＋脛骨橫向骨搬移治療組；與A組比a P ＞0.05、b P ＜0.01、c P ＜0.0001；與C 組比d PP ＞0.05、e P ＜0.01、f P ＜0.0001；與B 組比g P ＜0.0001、h P ＜0.05、i P ＞0.05；與C組比j P ＜0.0001

表2 4 組兔子在不同時間段TGF-β1 表達水平的比較( n=8，)

表2 4 組兔子在不同時間段TGF-β1 表達水平的比較( n=8，)

注：A 組：正常兔＋假手術組；B 組：正常兔＋脛骨橫向骨搬移治療組；C 組：糖尿病兔＋結合假手術組；D 組：糖尿病兔＋脛骨橫向骨搬移治療組；與A組比a P ＞0.05、b P ＜0.05、c P ＜0.0001、d P ＜0.01；與C 組比e P ＞0.05、f P ＜0.0001；與B 組比g P ＜0.001、h P ＜0.0001、i P ＞0.05；與C 組比j P ＜0.001、k P ＜0.0001、l P ＜0.01、n P ＞0.05

2.2 脛骨橫向骨搬移對GM-CSF 和TGF‐β1 表達水平的影響

圖1 實驗流程

A組和B組對照，在術前階段GM-CSF和TGF‐β1的表達水平無統(tǒng)計學差異（p＞0.05）(表1、表2)，術后各時間段GM-CSF，除外第12天P＞0.05，其他均P＜0.01（表1）；術后各時間段TGF‐β1，除外第12天P＞0.05，其他均P＜0.05（表2）。C組和D組對照，術后各時間段GM-CSF,均P＜0.01（表1）；術后各時間段TGF‐β1，除外第9天P＞0.05，其他均P＜0.0001（表2）。以上結果說明脛骨橫向骨搬移能促進GMCSF和TGF‐β1的表達水平。

3 討論

糖尿病已成為全球十大致死病因之一[8]，25%的糖尿病患者并發(fā)糖尿病足病，其中全球每年新增400萬的糖尿病足潰瘍，截肢的發(fā)生率高于非糖尿病患者的40倍，踝以上截肢患者的5年病死率高達70%[9]。如何有效地進行糖尿病足潰瘍的保肢治療是減少糖尿病患者致死、致殘的關鍵。臨床實踐表明糖尿病潰瘍創(chuàng)面的保肢治療需要多學科的協(xié)調：在內科治療控制血糖和生命體征平穩(wěn)的基礎上，外科治療主要是針對創(chuàng)面進行修復。在臨床研究中，國內多中心報道稱脛骨橫向骨搬移技術在保肢的治療上取得了令人滿意的效果[10-11]，影像學上證實了骨搬移術后創(chuàng)面周圍毛細血管的再生[12]。在基礎研究中，有研究表明骨在適當?shù)臋C械力的作用下可刺激周圍毛細血管和軟組織的再生[13]。但骨搬移對臨近創(chuàng)面愈合潛在的作用機制還未有系統(tǒng)的研究。

糖尿病足潰瘍創(chuàng)面的特點是存在糖基化產物蓄積導致細胞浸潤延遲，上皮化緩慢，肉芽組織形成減少等情況，包括新生血管，膠原蛋白和成纖維組織增生減少和紊亂[14]。研究表明糖尿病潰瘍創(chuàng)面中GM-CSF和TGF‐β1表達呈下調趨勢，同時外源性的GM-CSF和TGF‐β1均能促進糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合[15-16]。在功能上，GM-CSF和TGF‐β1均是多功能的生長因子且互為協(xié)同，GM-CSF可促進TGF‐β1的表達而TGF‐β1可將單核細胞轉化成GM-CSF[17]。在炎癥期，GM-CSF和TGF‐β1均可通過釋放炎癥因子和趨化因子使大量巨噬細胞和中性粒細胞浸潤創(chuàng)面，并增強其吞噬能力和清理壞死組織脫落的功能[18]。同時GM-CSF可促使巨噬細胞分泌其他的生長因子：TGF‐β1、血管內皮生長因子、血小板衍生因子、表皮細胞生長因子等[19]。在增生期，TGF‐β1是成纖維細胞最強的趨化因子，促進成纖維細胞的分裂增殖和遷移轉化[20]。同時GM-CSF可使肌動蛋白和纖維蛋白的表達增加，共同增強細胞外基質的合成 。此外，GM-CSF和TGF‐β1均可使角質形成細胞和內皮細胞趨化增殖，促進創(chuàng)面的上皮化和血管化[18]。在重塑期，主要是針對細胞外基質的重構，TGF‐β1能趨化成纖維細胞轉變肌成纖維細胞，誘導細胞外基質的重構包括收縮創(chuàng)面和瘢痕形成[22]。雖然GM-CSF同樣能促進創(chuàng)面纖維和膠原的沉積，但更多的是促進其代謝防止過度的沉積，抑制瘢痕的過度增生從而加速創(chuàng)面的愈合[15]。本實驗也證明脛骨橫向骨搬移技術能夠影響GM-CSF和TGF‐β1的表達水平，提高GM-CSF和TGF‐β1在糖尿病潰瘍創(chuàng)面中的表達濃度進而影響創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，GM-CSF和TGF‐β1在創(chuàng)面愈合中提供了一個多細胞和多環(huán)節(jié)協(xié)同參與的過程，同時在本次動物實驗中也證實：脛骨橫向骨搬移能促進GM-CSF和TGF‐β1的表達水平提高，從而使趨化多種細胞的能力提高，達到改善創(chuàng)面各細胞浸潤延遲和糖基化產物蓄積的效應，這可能是脛骨橫向骨搬移促進糖尿病創(chuàng)面愈合的作用機制之一。但本實驗仍有不足之處，首先實驗本身在設計上忽略對創(chuàng)面的數(shù)據化分析，并且也未體現(xiàn)各階段創(chuàng)面組織的病理學表現(xiàn)，其次實驗中存在部分的數(shù)據誤差，可能是由于標本污染或測量差異造成。還有對于脛骨橫向骨搬移是通過什么信號通路上調組織因子和趨化細胞，還需要進一步的研究。