2個藍莓品種花芽休眠期抗氧化酶活性及內源激素含量動態變化分析*

楊玉春，魏永祥，魏 鑫，劉有春，王興東，孫 斌，張 舵，劉 成

（1 遼寧省果樹科學研究所，營口115009）（2 遼寧省農業科學院大連分院）

多年生植物具有芽休眠的特性，嚴格意義上來講它可以分為3個階段，即進入休眠、內休眠和恢復生長[1-3]。進入休眠是休眠的初級階段，發生在內休眠之前，通常伴隨季節轉換、溫度降低；內休眠又叫真休眠、自然休眠，這種狀態下即便外界環境是有利的，芽同樣不能夠恢復生長；恢復生長是芽萌動、萌發生長的階段，這一階段芽內部生理條件成熟，給予適宜環境芽即能萌發[4]。這3個階段受植物生命節律嚴格控制、互相交叉、共同控制著芽的休眠和生長。花芽是果樹開花結果最為重要的部位，低溫是影響花芽休眠的重要因素之一，一方面低溫可以誘導花芽進入休眠，另一方面冷量的累積有利于花芽生理成熟并在合適條件下恢復生長[5-6]。如果需冷量不足，植株就不能正常完成自然休眠全過程，進而引起生長發育障礙，導致花器官畸形或嚴重敗育，影響果樹可持續生產[7]。

藍莓（Vaccinium corymbosumL.）屬杜鵑花科越橘屬漿果類果樹，果實營養豐富，具有增強人體免疫力及保護視力等功效，被聯合國糧農組織推薦為第三代水果，是人類五大健康水果之一[8-9]。隨著人們生活水平的提高，藍莓作為一種保健水果需求量迅速擴大，栽培面積不斷增加。設施果樹栽培是豐富城鄉果籃子、節約能源、促進農業產業結構調整的設施產業之一[10-11]。藍莓溫室栽培不僅能夠實現反季生產，達到高產、優質、高效的目標，還可以延長藍莓鮮果供應的貨架期，從而達到滿足消費者需求、提高藍莓市場價值、增加種植戶收入的目的。目前我國藍莓溫室栽培過程中極易發生需冷量不足的現象，進而導致花芽萌發不整齊、生長結果不良[12-13]。前人雖然針對藍莓花芽休眠已進行了大量的探索，然而仍有很多問題尚不清楚。已知積累相同冷量恢復正常條件后，需冷量低的藍莓品種可以很快發芽，而需冷量高的品種則發芽晚，那么直接或間接導致花芽恢復生長差異的因素是什么？解決這一問題可為我們深入研討藍莓品種間休眠差異的具體機理奠定生理基礎。

為此，筆者以需冷量低、花芽萌發早的藍莓品種‘斯巴坦’和需冷量高、花芽萌發晚的藍莓品種‘伯克利’為試驗材料（前期篩選獲得），探討了二者在花芽休眠和萌動期間抗氧化酶活性以及內源激素含量的動態變化，以期為今后深入研究藍莓品種間休眠差異奠定生理基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為北高叢藍莓品種‘斯巴坦’（Spartan）和‘伯克利’（Berkeley），栽培在遼寧省營口市鲅魚圈區熊岳鎮遼寧省果樹科學研究所小漿果研究室試驗區，花芽需冷量分別為912、960 h，樹齡5 年。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法

于2017 年9 月15 日、10 月1 日、10 月20 日和2018 年1 月5 日4個時間點進行取樣（9 月15日至10 月20 日藍莓花芽處于進入休眠階段，記為休眠早期，1 月5 日藍莓花芽剛開始萌發，記為萌動期、恢復生長階段），選擇生長良好成熟枝條的頂端芽50個（含3 次重復），材料收集后立即液氮速凍，-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2.2 生理指標測定

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用NBT 法，過氧化氫酶（CAT）活性測定采用鉬酸銨比色法，藥品購自蘇州科銘生物技術有限公司。內源激素包括脫落酸（ABA）、生長素（IAA）、茉莉酸（JA）、水楊酸（SA），其含量的測定委托蘇州科銘生物技術有限公司。激素測定方法：稱取藍莓芽組織樣品1.0 g，液氮研磨至15 mL 離心管中，加入10 mL 冷卻甲醇-水-甲酸溶液（80∶19∶1，V/V/V），渦旋2 min，4 ℃提取12 h，浸提液10 000 r/min 離心10 min，吸取1.0 mL 上清液，加入9 mL 水，混勻過Oasis MCX 固相萃取小柱（3 cc/60 mg，美國Waters公司），2 mL 純水淋洗，最后用1.0 mL 甲醇洗脫，過0.22 μm 濾膜后上機（e2695 液相系統和Quattro Premier XE 三重四極桿串聯質譜系統）測定。

1.3 數據統計分析

試驗數據采用Excel 2010 進行統計并作圖，采用SPSS 23.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’藍莓花芽休眠期抗氧化酶活性變化

如圖1 所示，‘伯克利’SOD 活性呈先下降后上升的趨勢，‘斯巴坦’SOD 活性呈先上升后下降的趨勢，在10 月20 日比‘伯克利’高43.0%，差異顯著；‘伯克利’CAT 活性呈先上升后下降的趨勢，‘斯巴坦’CAT 活性與‘伯克利’變化一致，但總體較平穩，在10 月20 日和1 月5 日，分別比‘伯克利’高72.5%和183.8%，差異均顯著。

圖1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期抗氧化酶活性變化

2.2 ‘斯巴坦’和‘伯克利’藍莓花芽休眠期內源ABA、IAA 含量變化

如圖2 所示，‘伯克利’ABA 含量呈先上升后下降的趨勢，‘斯巴坦’ABA 含量基本呈上升狀態，且始終維持在較低水平，在10 月1 日和10 月20日，分別比‘伯克利’低43.4%和29.3%，差異均顯著；‘伯克利’IAA 含量呈先下降后上升再下降的趨勢，‘斯巴坦’IAA 含量呈先上升后下降的趨勢，且始終維持在較高水平，在10 月20 日和1 月5 日，分別比‘伯克利’高30.7%和107.1%，差異均顯著。

圖2 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期ABA、IAA 含量變化

2.3 ‘斯巴坦’和‘伯克利’藍莓花芽休眠期內源JA、SA 含量變化

如圖3 所示，‘伯克利’JA 含量呈先上升后下降的趨勢，‘斯巴坦’JA 含量呈下降狀態，且與‘伯克利’相比下降較快，特別是在10 月1 日和10 月20 日，分別比‘伯克利’低24.5%和29.8%，差異均顯著；‘伯克利’SA 含量呈先下降后上升再下降的趨勢，‘斯巴坦’SA 含量呈上升狀態，但2個品種SA 含量只在9 月15 日時有顯著差異，其他取樣時期無顯著差異。

圖3 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期JA、SA 含量變化

2.4 ‘斯巴坦’和‘伯克利’藍莓花芽休眠期內源激素相關性及比值分析

如表1 所示，‘斯巴坦’藍莓花芽IAA 與ABA、SA 均呈顯著正相關，與JA 呈顯著負相關，相關系數分別為0.749、0.849、-0.700；ABA 與JA 呈負相關，但沒達到顯著，與SA 呈顯著正相關，相關系數為0.651；JA 與SA 呈顯著負相關，相關系數為-0.606。‘伯克利’藍莓花芽內源激素相關性較差，僅IAA 與ABA 之間表現出顯著正相關，相關系數為0.582，其他激素之間無顯著相關性。

表1 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期內源激素相關性分析

如圖4 所示，‘斯巴坦’ABA/IAA 在整個花芽休眠期間變化較平穩，‘伯克利’ABA/IAA 在10 月1 日、10 月20 日、1 月5 日分別比‘斯巴坦’高1.7、0.8、1.0 倍，差異均顯著；‘斯巴坦’JA/IAA在整個花芽休眠期間總體呈下降趨勢，‘伯克利’JA/IAA 在10 月1 日、10 月20 日分別比‘斯巴坦’高0.9、0.8 倍，差異均顯著；‘斯巴坦’JA/SA 在整個花芽休眠期間總體呈下降趨勢，‘伯克利’JA/SA在10 月1 日比‘斯巴坦’高0.6 倍，差異顯著；‘斯巴坦’SA/IAA 在整個花芽休眠期間變化較平穩，‘伯克利’SA/IAA 在9 月15 日、1 月5 日分別比‘斯巴坦’高0.8、1.0 倍，差異均顯著。

圖4 ‘斯巴坦’和‘伯克利’花芽休眠期各內源激素之間的比值

3 討論與結論

植物的芽端分生組織包含一類具有多潛能性的干細胞，它可不斷分裂分化產生新的器官原基[14]。休眠意味著分生組織活性靜止，這是多年生植物面臨外界環境壓力時所采取的一種生存策略[15]。研究表明，植物的氧化還原平衡調節植物芽端分生組織活性，直接或間接影響芽休眠，這在其他物種中均有過相關報道，比如馬鈴薯、葡萄等[16-19]。SOD 可以催化O2-形成H2O2，CAT 則直接清除H2O2。本試驗結果表明，在休眠前期‘斯巴坦’藍莓花芽SOD活性以及萌動期CAT 活性均顯著高于‘伯克利’藍莓，說明‘斯巴坦’藍莓花芽活性氧代謝效率高，可以快速清除活性氧，即可以在早期將O2-轉化成H2O2，并在芽恢復生長階段通過CAT 快速清除，避免花芽中活性氧累積。反之，‘伯克利’藍莓花芽SOD 活性雖整體呈上調趨勢，但SOD、CAT 活性均比較低，說明‘伯克利’藍莓花芽活性氧清除能力不足。可見，抗氧化酶活性高可以及時清除活性氧是‘斯巴坦’藍莓芽恢復生長快速萌發的重要因素之一。

植物激素在誘導和維持芽休眠進程中發揮著重要作用，本試驗結果表明，在10 月1—20 日‘伯克利’和‘斯巴坦’藍莓花芽中ABA、IAA 含量均呈上升趨勢，但‘伯克利’花芽中ABA 含量顯著高于‘斯巴坦’藍莓，IAA 含量顯著低于‘斯巴坦’藍莓。通過分析2種激素的比值，可以看出‘伯克利’藍莓花芽ABA/IAA 顯著高于‘斯巴坦’。出現這種情況的原因可能是‘伯克利’藍莓花芽中ABA含量高阻礙了生長素的流入，以致其IAA 含量低，而對應ABA/IAA 比值高，芽在后期萌發晚。相反‘斯巴坦’藍莓花芽中ABA 含量低，有利于促生長因子IAA 進入芽，所以ABA/IAA 比值低，芽在后期萌發快。因為，當植物進入休眠時ABA 會誘導胞間連絲閉合阻滯促進生長因子通過胞間連絲進入芽，高水平的ABA 還會限制機體內細胞代謝[20-21]，而生長素是芽恢復生長階段促進芽生長的重要因子，生長素可以促進細胞增殖、細胞生長、花芽分化[22-23]。本試驗還發現，2個藍莓品種中ABA 與IAA 均呈顯著正相關，其中‘斯巴坦’藍莓ABA 與IAA 相關系數（0.749）更高，‘伯克利’藍莓中ABA 與IAA 相關系數僅為0.582，意味著導致‘伯克利’藍莓促生長因子不能有效進入芽的阻遏因素除了ABA 可能還存在其他因素。ABA 與IAA 之間具體的調節關系還需要進一步研究分析。綜上所述，‘伯克利’藍莓需冷量高、花芽萌發晚與花芽中ABA 含量高和IAA 含量低有關。

水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）在花芽休眠過程中同樣發揮著重要的功能。本試驗結果表明，2個藍莓品種花芽休眠期間SA 并沒有表現出比較明顯的差異，具體原因有待進一步分析，但‘斯巴坦’藍莓JA 降解率和水平均顯著低于‘伯克利’。茉莉酸阻滯細胞周期進程，抑制G2/M 期轉換，進而抑制細胞分裂[24]，茉莉酸是脂類物質的衍生物，有研究表明此類物質的存在有利于維持芽的休眠[25-26]。本試驗結果顯示，‘斯巴坦’藍莓花芽可以快速地下調JA 并維持較低的水平，這表明維持低水平的JA 含量有利于細胞分裂、芽恢復生長。

綜上所述，‘伯克利’藍莓比‘斯巴坦’藍莓冷量積累多、花芽萌發晚與不能夠及時清除活性氧，ABA、JA 含量高，IAA 含量低有關。