外周血CD4+CXCR5+Tfh水平對肺炎克雷伯菌感染者預后的影響

王雪峰，蒙 艷，秋 霞

肺炎克雷伯菌屬于兼性厭氧的條件致病菌，是醫院感染的主要病原菌之一，多發生于住院的體弱患者，尤其是ICU患者[1]。肺炎克雷伯菌可引起患者多部位發生感染，肺部最常見。因肺炎克雷伯菌對多種抗生素耐藥，所以感染者預后較差，病死率高[1-2]，已成為影響患者生命安全的重要因素。因此，預防肺炎克雷伯菌感染、早期實施治療、準確評估患者預后顯得尤為重要。濾泡輔助性T細胞（T follicular helper cell,Tfh）是一類位于淋巴濾泡的CD4+T細胞亞群，高表達趨化因子受體CXCR5，參與多種免疫與感染相關疾病發生過程[3-4]。既往研究顯示，肺炎克雷伯菌等病原菌感染與體液免疫有關，而CD4+CXCR5+Tfh可參與免疫應答[5-6]。因此，推測CD4+CXCR5+Tfh可能在肺炎克雷伯菌入侵人體后的疾病進展中發揮重要作用。本研究擬通過檢測147例患者外周血CD4+CXCR5+Tfh水平，分析其與肺炎克雷伯菌感染的相關性及對患者預后的影響，以期為肺炎克雷伯菌感染者預后改善提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2017年7月—2019年5月于西寧市第二人民醫院ICU住院治療的147例患者為研究對象。患者入院時急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ）均為5～12分（APACHEⅡ計算出急性生理學評分、年齡調整、慢性健康調整數據，將數據相加獲得APACHE Ⅱ總評分，當評分在5～15分之間為重癥，評分在16～35分之間為危重癥，評分＞35分為極危重癥）[7]。根據患者入院后是否出現肺炎克雷伯菌感染將其分為感染組（69例）和未感染組（78例）。根據感染組患者1年內生存情況，將其分為生存組（40例）和死亡組（29例）。

納入標準：①肺炎克雷伯菌感染者均通過細菌培養確診[8]；②病例資料齊全。排除標準：①近1周內使用抗炎藥物、免疫抑制劑者；②伴有其他血液系統及自身免疫疾病者；③妊娠期或哺乳期婦女。本研究經我院臨床研究倫理委員會批準，所有研究對象均為自愿參加。

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集及保存 采集患者入院第2 d晨起空腹外周靜脈血，密度梯度離心法獲取單個核細胞，液氮冷凍保存待測。

1.2.2 CD4+CXCR5+Tfh水平測定 采用流式細胞術檢測外周血CD4+CXCR5+Tfh水平。用淋巴細胞分離液將外周血單個核細胞分離后放入流式管，加入2 ml PBS緩沖液，1500 r/min離心5 min，棄上清，重復3次，控制細胞濃度在5×105個/ml左右，向流式管中加入5 μl CD4抗體（貨號：251723，購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司）和1.5 μl CXCR5抗體（貨號：H00000643-D01P，購自上海科敏生物科技有限公司）后混勻，室溫孵育30 min，洗滌后重懸細胞，使用流式細胞儀（型號：BDFACSAria，購自美國BD公司）檢測處理好的標本，每份標本至少獲取10 000個細胞進行分析，記錄CD4+CXCR5+Tfh占CD4+T細胞的百分比。

1.3 統計學處理 利用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料符合正態分布，以±s表示，2組間比較行成組t檢驗。計數資料以例（%）表示，組間比較行四格表χ2檢驗。采用多因素Logistic回歸分析肺炎克雷伯菌感染者預后的影響因素。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 2組外周血CD4+CXCR5+Tfh水平比較 感染組外周血CD4+CXCR5+Tfh水平為（17.62±2.13）%，顯著高于未感染組的（5.86±0.91）%，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 感染組與未感染組外周血CD4+CXCR5+Tfh水平比較（±s）Table 1 Comparison of CD4+CXCR5+Tfh levels in peripheral blood between infection group and non-infection group(±s)

表1 感染組與未感染組外周血CD4+CXCR5+Tfh水平比較（±s）Table 1 Comparison of CD4+CXCR5+Tfh levels in peripheral blood between infection group and non-infection group(±s)

組別 例數 CD4+CXCR5+Tfh(%)未感染組 78 5.86±0.91感染組 69 17.62±2.13 t值 44.409 P值 0.000

2.2 肺炎克雷伯菌感染的單因素分析 感染組的住院時間、入住ICU時間、入住ICU時APACHE II評分、機械通氣時間及心血管疾病、多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome,MODS）、接受手術、惡性腫瘤患者的比例均高于未感染組，差異均有統計學意義（P均＜0.05）；2組年齡、性別、入院病因及慢性腎功能衰竭患者比例比較差異均無統計學意義（P均＞0.05），見表2。

表2 肺炎克雷伯菌感染的單因素分析Table 2 Univariate analysis on Klebsiella pneumoniae infection

2.3 2組預后情況比較 分析感染組與未感染組患者1年內生存情況，結果顯示，感染組1年病死率為42.03%（29/69），高于未感染組的19.23%（15/78），差異有統計學意義（χ2=9.073，P=0.003）。

2.4 肺炎克雷伯菌感染者預后的單因素分析 感染組中，死亡患者外周血CD4+CXCR5+Tfh水平、住院時間、入住ICU時間、入住ICU時APACHE II評分、機械通氣時間及碳青霉烯類耐藥、慢性腎功能衰竭、心血管疾病、MODS、接受手術、惡性腫瘤患者比例均高于生存患者，差異均有統計學意義（P均＜0.05）；此外，死亡患者與生存患者年齡、性別、入院病因比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05），見表3。

表3 肺炎克雷伯菌感染者預后的單因素分析Table 3 Univariate analysis on prognosis of patients with Klebsiella pneumoniae infection

2.5 肺炎克雷伯菌感染者預后的多因素Logistic回歸分析 結合既往文獻[9]進行變量篩選，將慢性腎功能衰竭、心血管疾病、住院時間排除在模型外。將肺炎克雷伯菌感染者是否死亡作為因變量，以CD4+CXCR5+Tfh、是否碳青霉烯類耐藥、是否出現MODS、是否接受手術、是否有惡性腫瘤、入住ICU時間、入住ICU時APACHE II評分、機械通氣時間作為自變量進行Logistic回歸分析，結果顯示CD4+CXCR5+Tfh、碳青霉烯類耐藥、入住ICU時APACHE II評分是影響肺炎克雷伯菌感染者死亡的獨立危險因素（P均＜0.05），見表4。

表4 肺炎克雷伯菌感染者預后的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on prognosis of patients with Klebsiella pneumoniae infection

3 討 論

肺炎克雷伯菌是一種腸桿菌科革蘭陰性桿菌，可引起消化道、泌尿道、手術切口、皮膚軟組織等多部位感染[10-11]。病原體一般可通過患者上呼吸道、霧化器、人工呼吸器及其他侵入式導管進入人體[12]。近年來，隨著肺炎克雷伯菌耐藥性增加，其臨床治療越來越困難，感染者病死率隨之增加[13-14]。Tfh是B細胞中的一員，其功能異常與免疫系統及多種疾病的發生有關[15-16]。研究表明，Tfh是淋巴濾泡趨化因子CXCL13的受體，可被CXCL13趨化，進而募集到淋巴濾泡，最終對B淋巴細胞增殖與分化產生刺激，形成生發中心，此外Tfh還可促使免疫球蛋白發生類別轉換[17-18]。因此，探究CD4+CXCR5+Tfh與肺炎克雷伯菌感染與預后的關系，對預防患者肺炎克雷伯菌感染、降低患者病死率具有重要意義。

本研究結果顯示，肺炎克雷伯菌感染組外周血CD4+CXCR5+Tfh水平顯著高于未感染組，與申衛紅等[19]研究結果一致。上述研究結果提示，臨床研究中外周血CD4+CXCR5+Tfh水平的異常升高對評估肺炎克雷伯菌感染有重要意義，早期評估感染發生風險可有效降低感染率。此外，本研究發現，肺炎克雷伯菌感染組中死亡患者外周血CD4+CXCR5+Tfh水平顯著高于生存患者，進一步表明CD4+CXCR5+Tfh是肺炎克雷伯菌感染者死亡的獨立危險影響因素，提示CD4+CXCR5+Tfh可能通過異常高表達在肺炎克雷伯菌感染過程中發揮重要作用，推測其可能機制為：肺炎克雷伯菌侵入人體后，成纖維細胞、巨噬細胞等炎癥細胞釋放增多，大量炎性因子產生，CXCL13水平升高，CXCL13趨化Tfh，進而募集到淋巴濾泡，進一步向生發中心和B淋巴細胞遷移，促進B淋巴細胞在生發中心增殖產生大量的免疫球蛋白，最終參與機體免疫應答反應。因此，CD4+CXCR5+Tfh水平增加不僅能提示患者發生感染，而且對評估患者感染程度有重要意義，有利于臨床醫師及時調整治療方案。

本研究結果表明，肺炎克雷伯菌感染及其不良預后均與患者是否患心血管疾病、是否患MODS、是否接受手術、是否有惡性腫瘤、住院時間、入住ICU時間、入住ICU時APACHE II評分、機械通氣時間有關，與唐麗玲等[20]研究結果部分一致。陳菲等[21]及田艷麗等[22]研究結果顯示，肺炎克雷伯菌耐藥性嚴重，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌引起的醫院感染已引起重視。本研究多因素Logistic回歸分析結果表明，碳青霉烯類耐藥、入住ICU時APACHE II評分也是肺炎克雷伯菌感染者死亡的獨立危險影響因素。上述結果提示，臨床要對伴有基礎疾病、接受過手術治療、住院時間較長、入住ICU時APACHE II高評分等患者予以重視，密切關注其是否存在感染情況，同時要嚴格掌握碳青霉烯類等藥物的使用指征，必要時可與抗生素聯合使用，降低耐藥率和病死率。本研究存在樣本量偏小、因素分析不全面等不足，今后須進一步增大樣本量、增加時間跨度、納入更多影響因素進行深入分析。

綜上所述，外周血CD4+CXCR5+Tfh水平在肺炎克雷伯菌感染者中顯著升高，CD4+CXCR5+Tfh可能通過參與機體免疫應答影響感染者的預后。檢測CD4+CXCR5+Tfh水平不僅對判斷感染者的免疫狀態有重要意義，也可為肺炎克雷伯菌感染者治療提供依據。