四種冷凍保護劑深低溫保存人小口徑動脈的實驗研究

蔡超操 陳世玖 王成 劉瓏玲 曾御

(遵義醫科大學第五附屬(珠海) 醫院燒傷整形手外科，廣東 珠海 519000)

近年來，在外科手術中,使用血管移植材料移植重建血管變得越來越常見[1-3]。目前對精子、卵細胞、胚胎等組織細胞的冷凍保存技術研究較為成熟，但對血管組織的深低溫保存多處于動物實驗階段，且實驗對象主要為大動脈或靜脈，比較不同冷凍保護劑深低溫冷凍保存人小口徑動脈的實驗研究報道罕見。本研究以病人放棄的小口徑動脈為研究對象，評估甘油，二甲基亞砜、丙二醇、乙二醇四種冷凍保護劑的凍存效果，為血管的深低溫保存提供依據。報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)實驗材料：本實驗材料為2016年9月至2018年9月遵義醫科大學附屬第五(珠海)醫院因外傷而行截肢術后遺棄的肢體，嚴格無菌操作，顯微鏡下剝離修剪小口徑動脈，每一片段0.5cm，收集45個片段。(2)主要實驗試劑：甘油:廣東恒健；丙二醇:山東酷爾；乙二醇:山東酷爾；二甲基亞砜:Amresco；RPMI-1640培養液:HyClone；胎牛血清:浙江天杭；蘇木素:博士德生物；HE染色試劑盒:博士德生物；即用型SABC-POD(小鼠/兔IgG)試劑盒:博士德生物；小鼠單克隆抗體[VG-1] to VEGFA (ab1316):Abcam。(3)主要儀器設備：液氮罐:河南天馳；高壓蒸汽滅菌器:廣州科鵬；生物組織包埋機:泰維科技；石蠟切片機(TB-718):湖北泰維；自動組織脫水機:leica biosystems；光學顯微鏡:重慶奧特。一般外科手術器械、顯微外科器械、手外科手術顯微鏡：由遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院手術室提供。

1.2實驗方法

1.2.1取材來源及血管制備 血管來源于無傳染病、血管疾病及惡性腫瘤患者因創傷而放棄的肢體，在無菌技術操作下切取小口徑動脈，將血管片段立即浸泡于4℃0.2%肝素生理鹽水中,并反復沖洗管腔,顯微鏡下見血管組織結構無明顯破壞，剝凈血管周圍結締組織,剪成長約0.5cm的血管片段，共收集45個片段。取材過程在6 h內完成，且盡量避免損傷血管內膜。

1.2.2實驗分組 隨機將45個血管片段分為9個組(8個實驗組：30%丙二醇組、30%二甲基亞砜組、30%乙二醇組、30%甘油組、40%丙二醇組、40%二甲基亞砜組、40%乙二醇組、40%甘油組；1個對照組)，每組5個血管片段。

1.2.3血管保護液配制 以胎牛血清、RPMI-1640培養液為基液，分別配制體積比為1:6:3、1:5:4的丙二醇、二甲基亞砜、乙二醇、甘油保護液。

1.2.4實驗步驟 1.肝素鹽水沖洗9組血管片段，分別先放入常溫含有10%各冷凍保護劑、10%胎牛血清，80%RPMI-1640培養液中30 min，再放入4℃含有30%各冷凍保護劑的玻璃化溶液中20 min，最后將各組血管隨機分別放入4℃含有40%各冷凍保護劑的玻璃化溶液內，所有標本冷平衡30 min。等滲平衡后將血管片段分別置入各不同濃度冷凍保護劑的玻璃化溶液的1ml凍存管內，4℃凍存 30 min后，移到﹣20℃凍存2 h再移到﹣80℃條件下過夜后投入到液氮罐中。2.快速復溫：凍存管從液氮內取出后，直接放入37℃水浴至完全融化，取出標本放入常溫0.5mol/L蔗糖溶液中,搖勻，洗脫10 min，去溶液，再加入0.25mol/L蔗糖溶液中,搖勻，洗脫10 min，去溶液，然后用Hanks液洗脫。3.玻片的制作：(1)將所取標本放入4%的多聚甲醛中固定12 h；(2)50%乙醇沖洗 30 min；(3)50%、70%、80%、90%乙醇脫水各 40 min，95%、100%乙醇脫水各兩次，每次20 min；(4)TO透明液透明 20 min；(5)依次在軟蠟和硬蠟中各浸2 h；(6)常規石蠟包埋。4.HE染色：(1)切片、展片、烤片；(2)組織切片常規脫蠟至水：TO透明液Ⅰ、TO透明液Ⅱ各5 min；100%無水乙醇Ⅰ、100%無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇依次各5 min，蒸餾水漂洗5 min×3次；(3)蘇木精液染色5 min；(4)流水洗去蘇木精液；(5)1%鹽酸酒精1 s；(6)稍水洗；(7)促藍液返藍5 s；(8)流水沖洗15 s；(9)0.5%伊紅液染色1 min；(10)蒸餾水稍洗1 min；(11)70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ各10 s，100%無水乙醇Ⅱ、100%無水乙醇Ⅰ各5 min；(12)中性樹膠封片后光鏡觀察；5.免疫組化染色:(1)切片、展片、烤片、脫蠟：60℃條件下烤片1 h，再行脫蠟水化處理：TO透明液Ⅰ、TO透明液Ⅱ各5 min；100%無水乙醇Ⅰ、100%無水乙醇Ⅱ、95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇依次各5 min，PBS洗3 min×3次。(2)抗原修復：檸檬酸鈉抗原修復液放入微波爐加熱至沸騰，后將切片放入抗原修復液加熱，高火5 min,中火7 min，自然冷卻至室溫后，PBS洗3 min×3次。(3)阻斷內源性過氧化物酶：滴加3%H2O2覆蓋組織，室溫孵育10 min，PBS洗3 min×3次。(4)封閉：5%BSA封閉液濕盒孵育30 min，甩干，勿洗。(5)滴加一抗：用免疫組化筆在距離組織邊緣2mm處畫圈，滴加一抗100ul后(小鼠或者兔IgG抗體,濃度為1：100)，置于4℃冰箱孵育過夜。第2日取出免疫組化濕盒，37 ℃室溫環境下孵育45 min，PBS充分淋洗5 min×3次。(6)滴加生物素標記羊抗兔/鼠IgG，室溫環境下孵育30 min，PBS充分淋洗5 min×3次。(7)滴加SABC，37℃孵育30 min，PBS充分淋洗5 min×3次。(8)DAB顯色：在棕色小玻璃瓶將DAB-A、DAB-B、DAB-C、蒸餾水各一滴混勻成DAB顯色工作液，現配現用。顯微鏡下查看切片顯色情況，約3 min顯色后，蒸餾水沖洗，停止顯色。(9)切片復染返藍：蘇木素染液染色時間1 min，流動自來水持續振洗1 min至無色，1%鹽酸酒精分化5 s，流動自來水持續振洗1 min，1%氨水返藍10 s，流動自來水持續振洗1 min。(10)脫水：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%無水乙醇Ⅰ、100%無水乙醇Ⅱ、TO透明液各3 min；組織完全干燥后，使用中性樹膠封片，然后顯微鏡下觀察。(11)Image-Pro Plus6.0軟件統計單位體積陽性染色區域的平均光密度值。

1.3統計學方法 使用SPSS 21.0統計學軟件進行統計學分析，計量資料采用t檢驗，多組間數據用單因素方差分析(ANOVA)，按α=0.05檢驗水準進行統計學分析。

2 結 果

2.1各組間HE染色結果：

圖1 對照組(HE染色×100) 圖2 30%乙二醇組(HE染色 ×100) 圖3 40%乙二醇組(HE染色 ×100)

圖4 30%丙二醇組(HE染色×100) 圖5 40%丙二醇組(HE染色 ×100) 圖6 30%甘油組(HE染色×100)

圖7 40%甘油組(HE染色 ×100) 圖8 30%二甲基亞砜組(HE染色×100 圖9 40%二甲基亞砜組(HE染色×100)

2.2各組間VEGF免疫組化檢測結果

2.2.1保護劑種類 如表1所示：在保護劑濃度為30%時，冷凍保護劑種類不同，所測得的小動脈VEGF平均光密度值也不相同。與對照組比較，甘油組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，丙二醇組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，乙二醇組小動脈VEGF平均光密度值升高，差異無統計學意義(P﹥0.05)；與乙二醇組比較，丙二醇組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，甘油組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與丙二醇組比較，甘油組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與甘油組相比較，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 30%濃度各組人小口徑動脈VEGF的檢測結果

如表2所示：在保護劑濃度為40%時，冷凍保護劑種類不同，所測得的小動脈VEGF平均光密度值也不相同。與對照組比較，甘油組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，丙二醇組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，乙二醇組小動脈VEGF平均光密度值升高，差異無統計學意義(P﹥0.05)；與乙二醇組比較，丙二醇組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，甘油組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與丙二醇組比較，甘油組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與甘油組相比較，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

表2 40%濃度各組人小口徑動脈VEGF的檢測結果

2.2.2保護劑濃度 如表3所示，隨著冷凍保護劑濃度地增加，丙二醇組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，二甲基亞砜組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，甘油組小口徑動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；乙二醇組小動脈VEGF平均光密度值顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

表3 不同濃度保護劑各組人小口徑動脈VEGF平均 光密度值(×102)的檢測結果

各組小動脈VEGF免疫組化結果圖示：

圖10 對照組(×200)圖11 30%乙二醇組(×200) 圖12 40%乙二醇組(×200)

圖13 30%丙二醇組(×200) 圖14 40%丙二醇組(×200) 圖15 30%甘油組(×200)

圖16 40%甘油組(×200) 圖17 30%二甲基亞砜組(×200) 圖18 40%二甲基亞砜組(×200)

3 討 論

冷凍保護劑對小動脈組織結構的影響表明這四種冷凍保護劑對人小口徑動脈有一定程度地保護作用。其作用機制可能是通過與溶液中的水分子結合，發生水合作用，減輕“細胞內冰晶損傷”，從而保護細胞和組織；此外，滲透性保護劑還可以滲透入細胞，使細胞避免處于過冷狀態，減少“溶質損傷”[4、5]。本研究中，二甲基亞砜組和甘油組可見血管損傷程度較輕，原有組織結構較完整，內皮細胞脫落較少，而丙二醇組表現為內皮細胞小片狀脫失，內彈力膜有部分空隙，表明丙二醇對小動脈的冷凍保護效果較甘油、二甲基亞砜差；乙二醇組見內皮細胞大片脫失,內彈性膜部分斷裂、缺失,平滑肌結構部分破壞，損傷較重，可見乙二醇的保護作用較二甲基亞砜、甘油、丙二醇差。

冷凍保護劑種類對小動脈血管內皮生長因子表達的影響:血管內皮生長因子(vascular endothelia growth factor，VEGF)是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子(heparin-binding growth factor)，是目前所有促血管生成因子中研究最多最清楚的一個[6]，能促進內皮細胞芽生[7、8]，誘導新生血管網絡的形成與重構[9-12]，在血管新生整個過程，發揮了不可取代的作用。本實驗通過免疫組化檢測VEGF的表達情況，評估血管的生物學功能。免疫組化檢測人小動脈VEGF表達情況表明：與對照組比較，甘油組、二甲基亞砜組、丙二醇組三組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P﹤0.05)，表示甘油組、二甲基亞砜組、丙二醇組小動脈 VEGF表達明顯增加，小動脈生物學功能較對照組好。與乙二醇組比較，丙二醇組、二甲基亞砜組、甘油組三組小動脈VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P﹤0.05)，其中，二甲基亞砜組平均光密度值高于甘油組，差異有統計學意義(P﹤0.05)，甘油組高于丙二醇組，差異有統計學意義(P﹤0.05)，表明經二甲基亞砜冷凍保存人小動脈快速復溫后生物學活性優于甘油，而甘油又優于丙二醇，丙二醇又優于乙二醇。與對照組比較，乙二醇組小動脈VEGF平均光密度值稍高，差異無統計學意義(P﹥0.05)，表明在本次實驗研究中，乙二醇對人小動脈的冷凍保護效果欠佳。雖然本實驗研究表明乙二醇對小動脈的冷凍保存效果較差，但Choi Y H[13]等人研究表明乙二醇對其他的組織或器官保存效果較好，這可能與被保存組織或器官種類相關。

冷凍保護劑濃度和毒性的關系：理想的冷凍保護劑的保存效果隨冷凍保護劑濃度的增加而增強，可以在冷卻和解凍期間防止細胞損傷，但濃度增高時，毒性也會在增強[14、15]。冷凍保護劑的毒性包括特異性毒性和非特異性毒性，特異性毒性僅發生在高溫或特定的細胞或器官中，主要包括：細胞膜毒性、氧化損害、滲透損傷、冷休克等；非特異性毒性可能是通過干擾水分子之間的氫鍵防止結冰而起到毒性作用[16、17]。毒性取決于多種因素，如冷凍保存時間、溫度和濃度、保存組織細胞類型、冷凍保護劑加入及去除時間、降溫及復溫速率等因素[18-21]，成功的深低溫保存與上述因素密不可分[22]。在本實驗中，當冷凍保護劑濃度不同時，通過免疫組化檢測VEGF的表達情況也有不同。隨著保護劑濃度的增加，丙二醇組、二甲基亞砜組、甘油組血管的VEGF平均光密度值顯著升高，差異有統計學意義(P﹤0.05)，表示血管的生物學活性增強，而40%乙二醇組血管VEGF平均光密度值明顯低于30%乙二醇組，差異有統計學意義(P﹤0.05)，表明乙二醇的濃度由30%上升至40%時，保護效果增強，但同時毒性亦增強，綜合結果導致血管的生物學活性減弱。

綜上所述，本研究進一步證實了冷凍保護劑在血管深低溫保存過程中的保護作用，研究結果表明二甲基亞砜、甘油、丙二醇對人小動脈的深低溫保存有保護作用，乙二醇的冷凍保護作用不明顯，其中，40%體積濃度的二甲基亞砜對人小口徑動脈的冷凍保護效果較甘油、丙二醇、乙二醇好。