基于MAPK/ERK信號通路探討當歸多糖 對腦缺血再灌注損傷大鼠的影響

湯定中 余春麗 羅國君△

(上海市第六人民醫院金山分院 1.神經內科;2.腎病科 上海 201599)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI)是腦血流不足或中斷致腦組織缺血缺氧一段時間，之后血供恢復，以腦組織損傷程度和功能障礙反而加重為主要特征的復雜病理現象[1]。該病的臨床表現主要為感覺、運動或意識嚴重障礙等。CIRI是大部分缺血性腦血管病的重要病理生理過程，近年來，隨著缺血性腦血管病發病率逐年增加，CIRI發生的幾率也不斷升高，并且拉高了腦血管病患者的殘疾率、死亡率[2]，對患者生命健康造成嚴重威脅。目前，CIRI治療中常用的腦保護藥物為麻醉藥物、他汀類藥物、N-乙酰半胱氨酸、阿片類物質、磷酸肌酸、蛋白酶抑制劑等等[3]，它們通過不同途徑對腦損傷起到一定的改善作用，但尚無特效藥物。明確各種藥物的作用靶點及療效，開發新的腦保護藥物是該病的研究重點，而中醫藥是CIRI新藥研發的主要來源之一[4]。當歸多糖為中藥當歸的主要活性成分，林國芳等[5]研究發現，當歸多糖可能通過抑制神經元凋亡對CIRI大鼠發揮神經保護作用，但具體作用機制不明確。本次研究主要基于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(ERK)信號通路，探討當歸多糖對CIRI模型大鼠的影響。報告如下。

1 資料與方法

1.1材料 (1)研究對象：6～7周SPF級健康SD大鼠65只，均為雄性，體重250～280g，平均(263.46±9.54)g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。將所有大鼠每籠5只置于飼養室內進行為期5 d的適應性飼養，溫度設定為24℃～26℃，相對濕度維持在50%～70%，光照時間6:00～18:00，大鼠在籠內自由活動并攝入標準顆粒飼料及清潔飲水，定期清掃鼠籠并消毒。(2)主要藥品與試劑：當歸多糖，純度≥98%，貨號：s31086，規格：每瓶25 g，購自蘇州瑞諾德生物科技有限公司，使用時采用蒸餾水配制成濃度為3 mg/mL、6 mg/mL的當歸多糖溶液，現用現配。尼莫地平片，規格：每片20 mg，批號：20180613，購自亞寶藥業集團股份有限公司，使用時用蒸餾水配制成濃度為1.5 mg/mL的尼莫地平混懸液，現用現配。PBS、TBST緩沖液，購自北京華邁科生物技術有限責任公司；末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的脫氧尿三磷酸(dUTP)缺口末端標記測定法(TUNEL法)細胞凋亡檢測試劑盒，購自上海恒斐生物科技有限公司；二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒，購自北京百奧萊博科技有限公司；大鼠B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)酶聯免疫分析(ELISA)檢測試劑盒，購自武漢菲恩生物科技有限公司；RIPA組織裂解液，購自北京碧橙藍生物科技有限責任公司；兔抗磷酸化原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-1(p-Raf1)、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶2(p-MEK2)、磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2(p-ERK1/2)、β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體，購自北京孚博生物科技有限公司；羊抗兔IgG-HRP(辣根過氧化物酶標記抗體)，購自上海恒斐生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺 (SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒，購自金克隆(北京)生物技術有限公司；ECL化學發光檢測試劑盒，購自愛必信(上海)生物科技有限公司。(3)主要儀器設備：ID-Centrifuge 12 S II型離心機，瑞士DiaMed GmbH公司產品；EM-3000型光學顯微鏡，日本多美公司產品；SUNRISE型酶標儀，瑞士TECAN公司產品；GeneQuant Pro型超微核酸蛋白檢測儀，美國GE公司產品；HYDRASYS 2型全自動電泳儀，法國SEBIA公司產品；Trans-Blot型轉膜儀，美國BIO-RAD公司產品。

1.2方法 (1)造模及實驗方法[6]：適應性飼養完成后，將所有大鼠依照隨機數字表法分為對照組12只和造模組53只。腹腔注射4%水合氯醛350 mg/kg麻醉大鼠，仰臥位固定于小動物手術臺上，頸前右側常規備皮消毒，于頸正中線右側旁開0.5 cm處作縱向切口，逐層分離組織，暴露右頸總動脈，分離右頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)及翼腭動脈(PPA)，造模組用4號手術線將ECA遠心端和PPA近心端結扎，動脈夾夾閉CCA、ICA，于距離ICA和ECA交叉部4 mm的ECA結扎處剪“V”形切口，長度為0.2 mm左右，并將4號手術線穿過交叉部3 mm內；“V”形切口內插入2-0尼龍魚線，去掉夾閉ICA的動脈夾，將線栓(2-0尼龍魚線頭端5 mm用石蠟包被，且標記18 mm處)依次經ECA-ICA和ECA交叉部-ICA-大腦前動脈(ACA)、中動脈(MCA)分叉處插入16 mm～18mm，阻斷MCA入口，切口外留線栓1 cm左右；將ECA遠心端結扎并固定線栓；對照組僅分離動脈，不進行栓塞；去掉夾閉CCA的動脈夾，縫合皮膚；2 h后，輕輕拉出線栓，感受到阻力時剪斷，將ECA近心端結扎；于傷口注射青霉素2.5 mg/kg以防止染。待大鼠清醒且生命體征穩定后，采用Zea longa神經功能缺失評分[6]評估大鼠神經功能，評分為1～3分即認為腦缺血再灌注損傷模型建立成功。將造模成功的48只大鼠隨機分為模型組、西藥組及當歸多糖低、高劑量組，各12只。模型組、對照組分別灌胃給予蒸餾水10 mL/kg，每日1次；西藥組灌胃給予1.5 mg/mL尼莫地平懸液10 mL/kg，每日1次；當歸多糖低、高劑量組分別灌胃給予3 mg/mL、6 mg/mL當歸多糖溶液10 mL/kg，每日1次。所有大鼠連續給藥7 d。(2)神經功能缺損評分評估：末次給藥次日，采用Zea Longa評分標準對大鼠神經功能進行評分：無神經功能缺損記0分；提尾時左側前肢伸展不完全記1分；自發行走時向左側轉圈記2分；自發行走時向左側跌倒記3分；意識喪失，不能自發行走記4分。(3)標本采集與處理[7]：麻醉后于冰上斷頭取腦，自缺血側腦組織重分離海馬組織，其中1/2液氮速凍后保存于-80℃冰箱內，以備蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測；另外1/2海馬組織加入10倍體積預冷的生理鹽水，充分勻漿后，以3 000 r/min速度離心15 min，將組織上清液保存在-70 ℃冰箱內。剩余缺血側腦組織置于4%多聚甲醛內固定48 h，經二甲苯透明、梯度酒精脫水、石蠟包埋后，制備2 μm切片，于冷水內展片放于載玻片上，65℃烘干1 h，4℃保存備檢。(4)TUNEL法檢測大鼠缺血側腦組織凋亡細胞數[8]：將(3)中制備的組織切片取出，恢復至室溫，采用二甲苯脫蠟10 min×2 次，100%-100%-95%-95%-80%-80%-70%-70%酒精依次處理5 min，然后去離子水沖洗2 min×3 次使切片水化；采用終止液50 mL處理切片5 min使內源性過氧化物酶失活，去離子水沖洗2 min×3 次；按照試劑盒說明書配制TUNEL反應液，取50 μL處理切片，37 ℃反應5 min后終止，PBS沖洗2 min×3 次；取HRP標記鏈霉親和素溶液50 μL處理切片，18 ℃反應10 min后，PBS沖洗2 min×3 次；采用DAB顯色試劑盒室溫染色6 min，去離子水漂洗10 s后，用甲基綠溶液染色3 min；依次采用去離子水漂洗、70%-90%-95%-95%-100%酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察染色結果，凋亡陽性細胞的細胞核呈棕色，于400倍鏡下，每張切片隨機選擇5個不重復視野，計數凋亡細胞個數，并取平均值。(5)ELISA法檢測大鼠海馬組織Bcl-2和Bax水平[9]：將1.2.3中制備的海馬組織上清液取出，4℃緩慢融化并恢復至室溫，按照ELISA試劑盒說明書，采用SUNRISE型酶標儀測定海馬組織上清液內Bcl-2和Bax水平。(6)Western Blot法檢測大鼠海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達水平[8]將(3)中保存的海馬組織取出100 mg，置于玻璃勻漿器內，加入RIPA組織裂解液(含苯甲基磺酰氟)1 mL，于冰上勻漿30 min，超聲裂解5 s×3次，4℃、12000 r/min速度離心5 min，分離上清液，采用超微核酸蛋白檢測儀測定總蛋白濃度；取蛋白樣本，加入2×蛋白上樣緩沖液10 μL，煮沸5 min，冷卻備用；按照試劑盒說明配制SDS-PAGE10%分離膠和5%濃縮膠，注入電泳儀上；上樣，開始電泳，電壓為濃縮膠80 V、分離膠120 V；采用轉膜儀將目的蛋白條帶轉印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，TBST洗膜10 min×3次；PVDF膜置于5%脫脂奶粉封閉液內，室溫搖床封閉1.5 h；PVDF膜置于p-Raf1(1：1 000稀釋)、p-MEK2(1：1 000稀釋)、p-ERK1/2(1：800稀釋)、β-actin(1：2 000稀釋)一抗工作液內,4℃孵育過夜，取出后TBST洗膜10 min×3次；將PVDF膜置于羊抗鼠二抗工作液(1:5 000稀釋)內，室溫孵育2 h，取出后TBST洗膜10 min×3次；采用ECL處理PVDF膜5 min后曝光。掃描曝光后的底片，用Quantity one軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白相對于β-actin的表達量。

1.3統計學方法 所有統計數據均統一整理，采用spss22.0軟件包分析，符合正態性的計量資料采用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05存在統計學意義；組間多重比較采用LSD-t檢驗，P<0.05存在統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠神經功能缺損評分比較 與對照組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分明顯較高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，當歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠神經功能缺損評分較低，且當歸多糖低劑量組>當歸多糖高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。 見表1。

表1 各組大鼠神經功能缺損評分比較

2.2各組大鼠缺血側腦組織凋亡細胞數比較 TUNEL染色結果顯示，對照組有少量凋亡細胞存在(見圖1A)；模型組可見大量棕色凋亡細胞核(見圖1B)；當歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠凋亡細胞數量較模型組有不同程度減少(見圖1C、D、E)。定量分析顯示，與對照組比較，模型組大鼠缺血側腦組織凋亡細胞數明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，當歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠缺血側腦組織凋亡細胞數均較低，且當歸多糖低劑量組>當歸多糖高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。 見表2。

表2 各組大鼠缺血側腦組織凋亡細胞數比較

注：(A:對照組 B:模型組 C:當歸多糖低劑量組 D:當歸多糖高劑量組 E：西藥組)圖1 各組大鼠缺血側腦組織凋亡細胞觀察 (TUNEL染色，×400)

2.3各組大鼠海馬組織Bcl-2和Bax水平比較 與對照組比較，模型組大鼠海馬組織Bcl-2和Bax水平均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，當歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠海馬組織Bcl-2水平均較高，且當歸多糖低劑量組<當歸多糖高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，當歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠海馬組織Bax水平均較低，且當歸多糖低劑量組>當歸多糖高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。 見表3。

表3 各組大鼠海馬組織Bcl-2和Bax水平比較

2.4各組大鼠海馬組織 p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達水平比較與對照組比較，模型組大鼠海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，當歸多糖低、高劑量組和西藥組大鼠海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達水平均較低，且當歸多糖低劑量組>當歸多糖高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)。 見表4，圖2。

表4 各組大鼠海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達水平比較

注：(A:對照組 B:模型組 C:當歸多糖低劑量組 D:當歸多糖高劑量組 E：西藥組)圖2 Western Blot法檢測各組大鼠海馬組織海馬組織 p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達結果

3 討 論

有報道稱[10-12]，MAPK途徑在腦、心臟等重要器官缺血再灌注時活化，在細胞凋亡誘導中發揮關鍵作用，改變其活化狀態有助于減輕組織損傷。

在此次研究中，我們即基于MAPK/ERK信號通路，探討當歸多糖對CIRI大鼠的影響。當歸多糖是中藥當歸中的額水溶性多糖物質，包括葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸等，藥理研究認為[13]，其具有調節免疫功能、促進造血、抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗輻射、防治肺纖維化、抗衰老等多種功效。閆安等[14]采用不同劑量的當歸多糖對線栓法制備的CIRI模型大鼠進行干預，發現其能通過減少腦組織氧化應激水平，以及抑制炎癥相關信號通路Toll樣受體-4/核轉錄因子-κB(TLR-4/NF-κB)激活的作用保護大鼠腦組織。方針等[15]研究則發現，當歸多糖能明顯促進CIRI大鼠模型的神經功能恢復和血管生成。由此可見，當歸多糖可通過不同機制干預CIRI進展。在本研究中，我們采用大腦中動脈阻塞法成功建立了CIRI大鼠模型，分別經不同濃度的當歸多糖和尼莫地平治療后發現，與模型組比較，各用藥組大鼠神經功能缺損評分較低，且當歸多糖低劑量組>當歸多糖高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)，Zea Longa評分是評估神經功能缺損程度的常用指標，得分越高，提示神經功能缺損越明顯，病情越嚴重，上述研究結果表明當歸多糖可以有效改善CIRI大鼠神經功能障礙，緩解病情，且藥物劑量越高，作用效果越明顯。TUNEL檢測結果顯示，與模型組比較，各用藥組大鼠缺血側腦組織凋亡細胞數均較低，且當歸多糖低劑量組>當歸多糖高劑量組和西藥組，差異有統計學意義(P<0.05)，表明高劑量當歸多糖能有效抑制神經細胞凋亡，減輕缺血側腦組織損傷。MAPK/ERK信號通路是MAPKs通路的一種類型，為調控細胞凋亡的常見通路。本研究結果顯示，與模型組比較，各給藥組大鼠海馬組織海馬組織Bcl-2水平較高，BAX及p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達水平均較低，且當歸多糖高劑量組和西藥組改變較模型組最明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，表明高劑量當歸多糖可以有效下調海馬組織p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達，進而提高海馬組織Bcl-2水平，降低海馬組織Bax水平，這可能是當歸多糖抑制CIRI大鼠腦組織細胞凋亡的作用機制之一。

綜上所述，當歸多糖能劑量依賴性的減輕腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能缺損，調節凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax水平，抑制缺血腦組織細胞凋亡，其作用可能與下調MAPK/ERK信號通路中的p-Raf1、p-MEK2、p-ERK1/2蛋白表達有關。