驢源馬鏈球菌馬亞種分離鑒定及消毒劑敏感性研究

平麗瑩，江婉玲，馬 勛，王 靜

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000）

馬腺疫（strangles）是由馬鏈球菌馬亞種（Streptococcus equisubsp.equi，SEE）引起的一種以發熱、精神沉郁、頜下及咽喉淋巴結膿腫等的臨床癥狀[1]，且具有種屬特異性的急性上呼吸道傳染病，是最常見的馬屬動物的傳染病之一[2-3]。馬鏈球菌馬亞種為鏈球菌屬C群成員，革蘭氏陽性，β溶血性鏈球菌，毒力基因包括透明質酸、肽聚糖、鏈球菌溶血素S等[4-6]，其中SeM蛋白是馬鏈球菌馬亞種重要的毒力因子，是細菌逃避吞噬作用和宿主免疫的重要保護性抗原，特異性高且高度保守，常被用來鑒定馬鏈球菌馬亞種[7-10]。

科學養殖、安全防控知識的缺乏導致驢感染馬鏈球菌馬亞種的病例時有發生[11]。現代規?；H場對于疫病的防控除了對病原體檢測和發病動物隔離治療等措施外，場區內外的環境消毒及進出人員和動物的消毒是防控疫病發生最主要的措施之一[12]。消毒劑按殺菌效果分為高效消毒劑、中效消毒劑和低效消毒劑[13]。高效消毒劑包括鹵素類消毒劑、氧化劑類消毒劑、醛類消毒劑；中效消毒劑包括含碘消毒劑、醇類消毒劑、酚類消毒劑；低效消毒劑包括季銨鹽類消毒劑[14]。高效消毒劑可殺滅各類微生物，包含其芽孢；中效消毒劑可殺滅細菌繁殖體以及多數病毒和真菌；低效消毒劑可殺滅親脂性病毒以及細菌繁殖體[15]。消毒劑的種類不同，殺菌機制也復雜多樣。如何科學選擇、使用消毒劑對于疫病防控極為重要。

2019年4月新疆石河子地區驢場發生一起疑似馬腺疫疫情，為明確病原，了解驢源馬鏈球菌馬亞種的環境適應性及對消毒劑的敏感性。本研究對石河子地區發病驢場病原菌進行分離鑒定，并對分離株在不同培養條件下的生長特性及常用消毒劑的敏感性進行測定，以期對規?；H場防控馬腺疫提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

新疆石河子某驢場臨床感染的驢及死亡驢頜下膿汁6份、肺部膿汁6份。

1.2 試驗試劑

BHI培養基購自青島高科技海博生物技術有限公司；胎牛血清、牛血清白蛋白、卵磷脂購自浙江天杭生物科技股份有限公司；PBS、新潔爾滅、來蘇水、碘附、84消毒液、吐溫80、硫代硫酸鈉購自北京市慶盛達化工技術有限公司；瓊脂粉購自上海索萊寶科技有限公司；革蘭氏染液購自珠海貝索生物技術有限公司；革蘭氏陽性菌GP鑒定卡購自北京蘭伯瑞生物技術有限公司；無水乙醇購自北京慶盛達化工技術有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 試驗儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠；HVA-85 Hirayama高壓滅菌器購自山東博科生物產品有限公司；48230V LabeyderPCR儀購自廣州市粵行儀器有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養振蕩器購自上海智城分析儀器制造有限公司；IS-RDV1立式單門雙層全溫振蕩器購自廣州市深華生物技術有限公司；VITEK2-compact30全自動微生物鑒定儀購自北京蘭伯瑞生物技術有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 病原菌分離純化及生化鑒定

取臨床感染的驢和死亡驢肺部及頜下膿汁直接接種于含5%脫纖維羊血BHI培養基，置于37℃恒溫培養箱培養24 h，挑取產生典型β溶血的菌落進行純化。

1.4.1.1 革蘭氏染色

挑取鮮血培養基β溶血菌落，使用生理鹽水制成細菌懸液，進行革蘭氏染色。在油鏡下鏡檢，觀察其形態結構和染色特性。

1.4.1.2 生化鑒定

挑取純培養物，采用GP鑒定卡及VITEK2-compac全自動微生物鑒定系統進行生化反應鑒定。

1.4.2seM測序鑒定

用細菌基因組提取試劑盒提取分離株DNA，引物參考《馬腺疫檢疫技術規范》（SN/T 2977—2011）擴增馬鏈球菌馬亞種seM基因。F5′-CAGAAAACTAAGTGCCGGTG-3′，R5′-ATTCGGTAAGAGCTTGACGC-3′，由北京華大基因科技有限公司合成。PCR擴增體系（總體積為20μL）：Premix Taq10μL、DNA模板2μL、上游引物1μL、下游引物1μL、超純水6μL。PCR擴增程序：95℃預變性5 min；95℃變性40 s，61.7℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35個循環；72℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行擴增片段大小的確定，并進行回收測序。

1.4.3 不同培養條件下的生長曲線的測定

取純化后的細菌液體培養，菌液濃度達到1×108~5×108CFU/mL。取200μL的菌液和20 mL添加5%牛血清的THB液體培養基于錐形瓶中，在不同培養溫度（25、37、42℃）、培養基pH值（4~9）、鹽濃度（1%~5%）條件下測定0、2、4、6、8、10、12、14 h菌液OD600nm值，繪制生長曲線。

1.4.4 常用消毒劑中和劑的篩選

將0.5%碘伏的中和劑設為0.5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+1%吐溫80和0.5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+3%吐溫80；0.2%新潔爾滅中和劑設為1%卵磷脂+1%吐溫80和1%卵磷脂+2%吐溫80；1 000 mg/L的84消毒液中和劑設為5%硫代硫酸鈉+1%卵磷脂+1%吐溫80和1%硫代硫酸鈉+2%卵磷脂+3%吐溫80；5%來蘇水中和劑設為3%吐溫80[16]。參照《消毒技術規范》[17]，設置6個試驗組，分別為：消毒劑+菌懸液、消毒劑+菌懸液、中和劑+菌懸液、消毒劑+中和劑+菌液、稀釋液+菌懸液（陽性對照）、稀釋液+中和劑+培養基（陰性對照）。試驗結果需符合第1組無菌生長，或僅有極少數分離株菌落生長；第2組有菌落生長，且較第1組為多，但較第3，4，5組少；第3~5組有相似量試驗菌生長，其組間菌落數誤差率應不超過15%；第6組無菌生長[18]。

1.4.5 常用消毒劑對驢源馬鏈球菌馬亞種殺菌率的檢測

取0.5 mL菌懸液、0.5 mL 3%牛血清白蛋白加入試管，混勻，置20℃水浴5 min后，加入不同濃度消毒液4.0 mL注入其中，迅速混勻并立即計時。至各預定時間后分別吸取0.5 mL混合液加于4.5 mL中和劑，混勻。作用10 min后，吸取1.0 mL混合液，按平板計數方法測定存活菌數，每管混合液接種2個培養基。陽性對照組用稀釋液代替消毒劑溶液，所得結果代表菌液原有濃度。消毒劑試驗設計見表1。消毒劑殺菌率的計算公式如下：

表1 消毒劑試驗分組Tab.1 Disinfectant test group

2 結果與分析

2.1 病原菌分離純化及生化特性（見圖1、表2）

從發病驢和死亡驢的下頜膿汁和死亡驢肺部膿汁共分離到4株菌，XJ201901為死亡驢下頜膿汁分離，XJ201902為死亡驢肺部分離，XJ201903和XJ201904為發病驢下頜膿汁分離。

由圖1可知，4株菌均為革蘭氏陽性，長鏈狀球菌，β溶血。

圖1 分離菌鏡檢及血平板培養情況Fig.1 Microscopic examination of isolates and blood plate culture

由表2可知，4株分離菌生化鑒定結果均為馬鏈球菌馬亞種，置信度94%。

表2 分離株生化鑒定結果Tab.2 Isolate biochemical identification results

2.2 PCR鑒定結果（見圖2）

圖2 seM基因PCR鑒定Fig.2 PCR amplification of SeM gene for isolates

4株分離菌提取基因組DNA后，用seM基因特異性引物擴增seM基因片段。由圖2可知，擴增產物經核酸電泳后可觀察到1條長約542 bp的片段，經過測序對比分析，結果顯示其序列與NCBI中登錄的驢源馬鏈球菌馬亞種seM基因序列（MH973488.1）同源性均超過99%，說明4株分離菌株均為馬鏈球菌馬亞種。

2.3 分離菌株不同培養條件下的生長特性（見圖3~圖5）

由圖3可知，4株分離菌在不同溫度下生長情況明顯不同，37℃條件下細菌生長迅速，4 h進入對數期并在8 h達到高峰，菌量可達108CFU/mL，8~14 h基本處于平臺期。25℃條件下細菌生長緩慢，培養10 h后才有明顯生長。42℃條件下，分離株比37℃早一步進入對數期，在6 h達到高峰，但總菌量低于37℃，平臺期維持時間較短，8 h之后快速進入衰亡期。

圖3 不同溫度條件下4株分離菌生長曲線Fig.3 Growth curves of four isolates at different temperatures

由圖4可知，4株分離菌在4%及5%鹽濃度時不生長。1%和2%鹽濃度4 h進入對數期，8~12 h處于平臺期，12 h后細菌開始衰亡，生長趨勢一致，但是2%鹽濃度下細菌總量低于1%鹽濃度3%鹽濃度條件下細菌生長緩慢12~14 h才達到其最大值。

圖4 不同鹽濃度條件下4株分離菌生長曲線Fig.4 Growth curve of four isolates at different salt concentrations

由圖5可知，4株分離菌在pH值為4、5、9時不生長；pH值為7、8時，細菌生長情況基本一致；但pH值為8條件下，細菌在衰亡期的下降要快于pH值為7的條件；pH值為6時，細菌生長緩慢，菌量始終顯著低于pH值7、8。

圖5 不同pH值條件下4株分離菌生長曲線Fig.5 Growth curves of four isolates at different pH values

2.4 常用消毒劑中和劑的篩選（見表3）

由表3可知，含1%卵磷脂和2%吐溫80的PBS溶液可有效中和0.2%新潔爾滅，含1%卵磷脂、3%吐溫80及0.5%硫代硫酸鈉的PBS溶液可有效中和0.5%碘伏，3%吐溫80的PBS溶液可有效中和5%來蘇水，含3%卵磷脂、2%吐溫80及1%硫代硫酸鈉的PBS溶液可有效中和1 000 mg/L的84消毒液。

表3 中和劑篩選試驗結果Tab.3 Results of neutralizer identification test

2.5 消毒劑對驢源馬鏈球菌馬亞種殺菌率的影響（見表4、表5）

分離鑒定表明，4株分離菌均為馬鏈球菌馬亞種且生長情況一致，試驗選取菌株XJ201901對殺菌率的測定。由表4、表5可知，0.5%碘伏、1∶15新潔爾滅、1 000 mg/L 84消毒液以及5%來蘇水溶液對驢源SEE的殺菌作用均達到100%。0.2%碘伏和500 mg/L消毒液的殺菌效果也可達到100%。0.05%碘伏、1%來蘇水、200 mg/L 84消毒液對驢源SEE的殺滅作用達到90%以上。而在稀釋更高倍數時1∶200新潔爾滅以及0.5%來蘇水溶液的殺菌率下降到64%~76%，且消毒時間并不能增強消毒效果。

表4 消毒劑殺菌率Table 4 Germicidal efficacy of disinfectants 單位：%

表5 消毒劑殺菌率Table 5 Germicidal efficacy of disinfectants 單位：%

3 討論

馬鏈球菌馬亞種對外界環境抵抗力較強，在水中可存活1 w，在干燥條件下可生存數周；對于熱的抵抗能力不高，煮沸即死[19-20]；在陽光直射下的木材、橡膠和金屬表面存活不到24 h；潮濕寒冷的環境可以提高SEE的生存能力[21]。本研究中，石河子發病驢場的驢在半露天圍欄中飼養，圍欄內躺臥位置沒有墊草，發病前石河子氣溫較低，小雨，雨后露天圍欄出現積水，有些驢躺臥在泥水中，種種因素導致驢機體抵抗力降低，陸續開始發病。本研究從臨床發病及死亡驢頜下及肺部濃汁分離得到4株馬鏈球菌馬亞種，且此前驢場無其他發病史和感染情況，同時在發病驢體內未分離到其他致病菌，表明此次驢場發病由馬鏈球菌馬亞種導致。通過對4株驢源馬鏈球菌馬亞種在不同培養條件下生長特性的測定，發現分離菌在高溫和偏堿環境中生長速度和細菌衰亡加快，室溫、3%NaCl、pH值6的條件下細菌生長緩慢，表明驢源馬鏈球菌馬亞種對高溫及酸性環境敏感。石河子地處北疆中段，冬季嚴寒，夏季炎熱。因此，提示在石河子重點做好冬季和冬春的消毒保健能起到事半功倍的防控效果。

本試驗研究的4種常用消毒劑，84消毒液屬于鹵素類消毒劑，高效消毒劑。來蘇水屬于酚類消毒劑，碘伏屬于含碘消毒劑，均為中效消毒劑。新潔爾滅屬于季銨鹽類消毒劑，低效消毒劑[22]。84消毒劑在一般物體表面消毒時推薦使用濃度為1 000 mg/L。有效碘含量5 g/L的碘伏在注射、外科洗手及手術部位擦拭消毒時均使用其5%原液[23]。中效消毒劑來蘇水推薦使用濃度在5%~1%之間；低效消毒劑新潔爾滅推薦皮膚及創面等消毒稀釋比1∶15，器械沖洗消毒稀釋比為1∶500[24]。試驗結果表明，4種常用消毒劑在推薦使用濃度下均可以有效殺滅驢源馬鏈球菌馬亞種。84消毒劑和來蘇水低于推薦使用濃度的5倍、碘伏低于使用濃度的10倍、新潔爾滅低于推薦使用濃度的7倍時，其殺菌效果將達不到預期效果。

4 結論

綜上所述，石河子地區驢場此次發病由馬鏈球菌馬亞種導致，對于馬腺疫的防控需嚴格按照消毒劑推薦使用劑量進行定期消毒，同時結合石河子氣候條件，利用夏季高溫晾曬，鹵素類消毒劑對驢舍進行全面消毒，提高馬腺疫的防控效果。