綿羊羔羊金黃色葡萄球菌與糞腸球菌混合感染的研究

阿迪萊·卡哈曼，伍麥爾·麥海提，布帕提買木·麥麥提，李蓮瑞，黃 新，石長青*

（1．塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300；2．新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；3．新疆農墾科學院，新疆 石河子 832000）

隨著養羊業高密度、集約化發展，加之規?；驁鲲曫B管理不當，往往會同時感染多種病原，造成誤診、濫用藥物和防治困難，導致羊群高致病率和高死亡率。近年來，放線菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌均能引起牛羊和其他家畜的非接觸傳染的慢性病，其中動物感染金黃色葡萄球菌與糞腸球菌較為常見，給養殖業帶來嚴重的經濟損失。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于革蘭氏陽性菌中的葡萄球菌屬（Staphylococcus），在自然界中廣泛存在，是常見的人畜共患病原[1]，可引起動物肺炎、敗血癥、心肌炎、腦膜炎等急性感染病和腸炎等慢性感染病[2]。糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）又稱糞腸球菌，也屬于條件致病菌[3]，呈橢圓形、成對或短鏈排列、菌落表面光滑，為兼性厭氧的革蘭陽性球菌，生存能力較強，在10~45℃的溫度范圍內可以正常生長。研究發現糞腸球菌是腸球菌屬中最常見的病原體，具有較強的致病性，繼鏈球菌和葡萄球菌之后的重要感染病原菌[4-6]。這種病原體會引起各種相關傳染病，如尿路感染、皮膚軟組織感染、傷口感染、菌血癥、腦膜炎等[7]。

新疆南疆某規?；驁鲈?020年9月出現羔羊陸續發病的情況，在15 d之內死亡8只，此后發病不斷。臨床癥狀表現為：初期體溫高達41~42℃、消瘦、精神沉郁、食欲減少、呼吸困難。肺臟呈彌漫性充血、出血、外觀呈大理石樣；膽囊腫大至原來的2~4倍。本次試驗對新疆喀什地區某羊場發病死亡羔羊組織病料中分離出的2株病原菌進行分離鑒定、分子生物學鑒定，明確了病原菌的藥物敏感性等生物學特性，確診此次羔羊發病為金黃色葡萄球菌和糞腸球菌混合感染所致，將為該病的診斷、治療和防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

2020年9月，在南疆喀什地區規模化羊場無菌采集8只病死羔羊的肺臟、脾臟、膽囊等組織，將采集的病料分別裝入離心管，存于-80℃冰箱，備用。

1.2 試驗動物

10周齡健康小鼠6只，體重為20~22 g，由塔里木大學動物實驗站提供。

1.3 試驗試劑

細菌基因組提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限 公 司；PremixT aq酶（ExTaq2.0Plus）、DL2000 DNA Marker，均購自TaKaRa公司；BHI液體培養基、LB培養基、MH培養基，均購自青島高科園海博生物技術有限公司；藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌分離培養

病料采用無菌采集的方法，切成約1 cm3的組織塊，進行涂片、革蘭染色；再將病料置于BHL肉湯培養基中，同時分別將組織病料涂布于LB固體培養基、BHI固體培養基和鮮血培養基中，37℃培養18~24 h；多個單菌落被挑取之后進行革蘭氏染色、瑞氏染色，鏡檢觀察。

1.4.2 引物的合成

運用細菌通用引物擴增金黃色葡萄球菌和糞腸球菌16S rDNA全長序列，16S rDNA基因擴增引物序列及預計擴增長度見表1。引物序列由上海生物工程有限公司合成。

表1 16S rDNA基因擴增引物序列及預計擴增長度Tab.1 16S rDNA gene amplification sequence and expected amplification length

1.4.3 目的基因的擴增

采用細菌通用的16S rDNA引物進行菌株基因片段擴增，對擴增出與目的條帶相符的部分PCR產物，反應體系為：DNA模板1μL、2×PCR MIX 12.5μL、上下游引物各0.5μL、ddH2O 10.5μL，振蕩混勻。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，34個循環，72℃再延伸10 min。同時，以ddH2O代替模板DNA作為空白對照。反應結束后，擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中，以1×TAE緩沖液電泳，觀察目的條帶，記錄陽性鑒定結果并拍照保存，進行測序以及分析。

1.4.4 動物致病性試驗

選取6只小白鼠隨機分為對照組、試驗組和攻毒試驗組。分離后挑取單菌落，接種到BHI培養液中，制備成細菌懸液，攻毒試驗組每只小鼠腹腔注射0.5×108CFU細菌懸液，0.2 mL/只，對照組注射同劑量的生理鹽水，對死亡的小鼠進行解剖，再將無菌采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟等病料做病原的分離與鑒定。

1.4.5 藥敏試驗

選擇氨芐西林、氯霉素、苯唑西林、氨芐西林、慶大霉素、卡那霉素、紅霉素、諾氟沙星、四環素、多西環素、多黏菌素B、萬古霉素等臨床常用的抗生素，將純培養物接種在MH培養基上，使用高壓過后的棉簽涂布均勻，將藥敏片以“花瓣狀”貼于MH培養基內，37℃恒溫箱中培養16~18 h，觀察并測量抑菌圈的大小。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養結果（見圖1~圖6）

將細菌接種在4種不同的培養基上。由圖1~圖4可知，LB培養基上生長不良；BHI肉湯培養基中出現輕度混濁，形成顆粒狀沉淀；BHI固體培養基上生長良好，形態為飽滿圓潤、表面光滑、邊緣整齊、半透明的圓形菌落；鮮血培養基上表現為圓形，周圍完全透明的草綠色溶血環。

圖1 LB固體培養基Fig.1 LB solid medium

圖4 BHI培養基Fig.4 BHI medium

由圖5、圖6可知，挑取單個菌落，進行革蘭、瑞氏染色，鏡檢可見有藍紫色圓形、卵圓形葡萄狀的金黃色葡萄球菌；橢圓形或圓形鏈狀排列的糞腸球菌。

圖2 BHI液體培養基Fig 2 BHI liquid medium

圖3 鮮血培養基Fig.3 Blood culture medium

圖5 金黃色葡萄球菌革蘭染色鏡檢（10×100）Fig 5 Gram staining microscopic examination of Staphylococcus aureus(10×100)

圖6 糞腸球菌瑞氏染色鏡檢（10×100）Fig.6 Swiss staining microscopic examination of Enterococcus faecalis(10×100)

2.2 16S rRNA PCR擴增結果（見圖7）

由圖7可知，對初步分離的金黃色葡萄球菌和糞腸球菌進行PCR擴增，電泳結果顯示目的片段為1 500 bp，與預期大小一致。

圖7 16S rRNAPCR擴增結果Fig.7 16S rRNA PCR amplification results

2.3 16S rRNA基因序列分析

在NCBI數據庫進行中同源性對比，結果表明，一株為金黃色葡萄球菌（登錄號為CP-0321601.1），同源性99.93%；另一株為糞腸球菌（登錄號為JN-560903.1），同源性為99.72%，這兩株菌同源性均高于99%，符合判定標準。

2.4 動物試驗結果（見圖8）

注射生理鹽水的兩只小鼠表現為良好的精神狀態，對照組的小鼠器官均正常，未發生病理變化。注射細菌懸液的2只小鼠在12~48 h內相繼全部死亡，立即將死亡的小鼠剖解。由圖8可知，與對照組相比，試驗組小鼠心臟有出血點，肝臟腫脹、發黑，脾臟腫大、軟、紫、紅色，肺臟充血、出血，腎臟質脆、變軟、出血。分別取2只小鼠組織進行病原的分離與鑒定及革蘭染色，可見一種為藍紫色圓形葡萄狀的球菌；另一種為橢圓形或圓形鏈狀排列的球菌，說明這兩種病原菌具有一定毒力，能夠致小白鼠死亡。

圖8 動物試驗解剖Fig.8 Anatomy of animal experiment

2.5 藥敏試驗結果（見表3）

表3 藥敏試驗結果Tab.3 Results of drug sensitivity test

由表3可知，金黃色葡萄球菌對β-內酰胺類抗生素氨芐西林、氨芐西林、氯霉素、苯唑西林產生耐藥性；對氨基糖苷類抗生素慶大霉素、卡那霉素產生耐藥性；對大環內酯類抗生素紅霉素表現為高度敏感；對多肽類抗生素多黏菌素B和萬古霉素產生耐藥性；對喹諾酮類抗生素諾氟沙星表現為高度敏感；對四環素類抗生素四環素、多西環素等產生耐藥性。

糞腸球菌對β-內酰胺類抗生素氨芐西林高度敏感；對氯霉素、氨芐西林耐藥；對氨基糖苷類抗生素慶大霉素、卡那霉素耐藥；對大環內酯類抗生素紅霉素高度敏感；對多肽類抗生素多黏菌素B和萬古霉素敏感；對喹諾酮類抗生素諾氟沙星高度敏感，對四環素類抗生素四環素、多西環素等藥物高度敏感，臨床用藥時可交替使用以上敏感藥物，可達到有效治療的目的。

3 討論

無菌采集病死羔羊肝臟、肺臟、脾臟等器官組織接種于不同培養基中，發現2種致病菌，經分離培養、藥敏試驗、動物試驗、16S rRNA基因序列分析，結果判定2種致病菌分別為金黃色葡萄球菌與糞腸球菌，表明本次引起該規?；驁龈嵫蛩劳龅闹饕≡鸀榻瘘S色葡萄球菌與糞腸球菌。

關于動物感染糞腸球菌的報道很多，但與金黃色葡萄球菌混合感染的報道較少[8]，主要是由于對此情況關注度不夠高。王亞賓等[9]發現，由糞腸球菌可引起仔豬關節炎，但對致病機理有待進一步研究。齊亞銀等[10]從羔羊中分離鑒定出羔羊腦炎型糞腸球菌，發現由于是機會感染菌，其感染途徑可能與溫度、氣候有關。陳一資等[11]分析了某鴨場暴發的糞腸球菌病，結果顯示，養殖場的環境、飼養條件給糞腸球菌提供了生長環境，導致疫病暴發。范輝[12]從雛雞中分離到1株致病性糞腸球菌。金黃色葡萄球菌與糞腸球菌都是環境中廣泛存在的條件致病菌[13]，羊場中發病羊為20~30日齡的羔羊，抵抗力較低，同時夏季是細菌性疾病多發的季節，當兩種條件致病菌混合感染后，環境出現變化時，條件致病菌就有機會出動，對羊體造成影響從而發病。本試驗中的規模化羊場環境良好，可以排除環境因素，推測由于是機會感染菌，感染途徑可能與氣候、溫度、營養、生殖器官的感染有關；另外也與臨床上濫用抗生素有關，其發病的機理有待一步研究。本次藥敏試驗中，兩種菌均敏感的藥物是卡那霉素、紅霉素、四環素和諾氟沙星，但混合感染一般不能提前用藥預防，尤其是環境出現驟變時難以預防，在此類混合感染的臨床治療中，應合理使用藥物，嚴禁濫用抗生素，應防止多藥耐藥菌株的出現和流行，并應加強監督和控制。

本試驗表明，喀什地區部分規?；驁鲱A防措施效果不理想，有金黃色葡萄球菌與糞腸球菌的感染情況，還需要加強飼養管理和疾病預防工作。針對羊場的現狀，建議采取防控措施：在引入動物時，必須進行檢驗和隔離觀察，確認羊健康，才能將混群飼養；加強飼養管理，采取防風防凍的措施，增強動物自身的抵抗力，也是預防這種疾病的重要舉措[14]；對未發病的動物可以用抗生素做預防性治療，或用疫苗進行緊急接種；此外，提高飼養人員技術水平是關鍵，增強飼養人員防控意識，通過進行理論知識的培訓從而提高科學飼養的技術水平，對治療疾病的技術進行學習培養，可以為疾病的早期發現和治療提供基本保證[15]。

4 結論

本試驗分離鑒定出金黃色葡萄球菌與糞腸球菌，發現該羊場發病羊為2種病原菌混合感染，對其進行藥敏試驗及毒力試驗，對本病提供可行性的防控措施。