微生態添加劑對蛋雞腸道微生物結構菌群的影響

嵇宏杰，匡 偉，姚 遠，何宗亮，伍冠鎖，羅奕秋，孫盼盼

（南京市畜牧家禽科學研究所，江蘇南京 210036）

目前，畜禽養殖逐步向規模化發展[1]。在畜禽養殖業中尋找抗生素有效的替代物已成為研究重點，腸道益生菌的開發研究成為當前熱點[2]。飼料中添加微生態制劑可以提高飼料利用率[3]，減少糞尿中氮的排放，抑制有害氣體的產生，是實現源頭減排的有效手段[4]。在蛋雞的腸道中，存在多種微生物[5]，以往對蛋雞腸道微生物的研究主要有微生物培養和DGGE技術，這2種技術均有不足，因此高通量測序技術應運而生。高通量測序技術能夠深入地觀察細菌多樣性。本試驗中，通過對腸道菌群進行高通量測序和分析，旨在研究微生態添加劑對蛋雞腸道微生物群落結構的影響，為蛋雞的健康養殖、提高腸道免疫能力、預防疾病發生以及微生態制劑的開發提供參考[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的微生態制劑由南京市福潤德有限公司生產，主要成分包括枯草芽孢桿菌（≥1×1012CFU/kg）、丁酸梭菌（≥1×1010CFU/kg）等。

1.2 試驗設計

選擇健康120日齡淮南麻黃雞，隨機分成4組，每組6個重復，每個重復5只雞。各組依次添加0、0.5、1.0、2.0 g/kg的微生態制劑。基礎日糧組成及營養水平見表1。試驗期為40 d。

表1 基礎日糧組成及營養水平Tab.1 Basal diet composition and nutritional level

試驗在南京市畜牧家禽科學研究所種雞場進行，蛋雞舍為全封閉，飼養模式為層疊式籠養。

1.3 測定指標及方法

試驗結束后，每組屠宰3只雞放血，取腸道（直腸和盲腸）食糜，送至南京市美吉生物公司進行微生物群落多樣性分析。

選用引物Nobar 431F和Nobar 609R來擴增的細菌，測序平臺為：Miseq2*300。

Miseq測序平臺先對序列質量進行質控和過濾操作，然后進行OUT聚類和物種分類學分析。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OUT代表序列進行分類學分析，能夠顯示物種多樣性以及多組樣本之間的差異。在OUT聚類分析的基礎上利用MEGAN分析，能夠顯示每個層級上各樣本菌群豐度。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2019軟件對原始數據整理，采用SPSS 26.0軟件進行顯著性分析，結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。使用美吉生信云平臺對測序結果進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 稀疏曲線與香農指數（shannon）分析（見圖1、圖2）

通過處理使樣本序列長度不低于500 bp，以滿足數據分析的要求。圖1與圖2分別是樣本的稀疏分析圖與shannon指數分析圖（Z代表直腸組，M代表盲腸組），其中每條曲線代表1個樣本。

由圖1可知，樣本的稀疏曲線均未達到平臺期，表示隨著序列數增加相應OUT數量也會增加。

圖1 48個試驗樣品的稀釋曲線分析圖Fig.1 Analysis of dilution curve of 48 test samples

由圖2可知，shannon曲線趨平說明微生物多樣性已經飽和。測序量增大或許會有新的種系，但多樣性已經飽和，說明本次測序數據量夠大，測序結果能夠充分反映微生態添加劑對蛋雞腸道菌群結構的微生物物種信息。

圖2 48個試驗樣品的shannon指數Fig.2 Shannon analysis of 48 test samples

2.2 Alpha多樣性分析（見表2~表4）

通過Alpha多樣性分析可以得到群落中物種豐度、覆蓋度和多樣性等信息。由表2可知，盲腸組腸道微生物Alpha多樣性不顯著，組間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 微生態添加劑對蛋雞盲腸Alpha多樣性的影響Tab.2 Effect of microecological additives on Alpha diversity of the caecum of laying hens

由表3可知，Z1、Z2組腸道微生物shannon指數差異顯著（P＜0.05），其余組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 微生態添加劑對蛋雞直腸Alpha多樣性的影響Tab.3 Effect of microecological additives on Alpha diversity of the rectum of laying hens

由 表4可知，M組與Z組在shannon、simpson、ace、chao、coverage上均存在顯著差異（P＜0.05）。

表4 腸道微生物Alpha多樣性Tab.4 Diversity alpha intestinal microflora

在蛋雞直腸和盲腸中，盲腸組shannon指數高，simpson指數低，表明微生態制劑對蛋雞盲腸微生物群落有影響，使其群落豐度增加，但對其菌群多樣性無影響。

2.3 微生物群落結構分析

2.3.1 微生態制劑對蛋雞腸道中微生物群落門水平上豐度變化的影響（見圖3、圖4、表5）

表5 微生態添加劑對腸道微生物群落在門水平上豐度的影響Tab.5 Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at the phylum level 單位：%

圖3 腸道微生物在門水平上的分度圖Fig.3 Phylum level division of intestinal microorganisms

圖4 腸道微生物在門水平上的熱圖Fig.4 Phylum level of intestinal microorganisms

由圖3可知，盲腸中，門水平優勢微生物群落按其豐度排序為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）；直腸中，厚壁菌門（Firmicutes）為門水平的優勢菌群。

由圖4可知，添加微生態制劑在蛋雞腸道中微生物群落豐度變化在門水平上主要有變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chlorcfiexi）、厭氧菌門（Halanaerobiaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、互養菌門（Synergistetes）等。

由表5可知，添加微生態制劑蛋雞腸道菌群在門水平上主要有：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）和其他一些占比較少的細菌門類。

2.3.2 微生態制劑對蛋雞腸道中微生物群落科水平上豐度變化的影響（見圖5、圖6、表6）

圖5 腸道微生物在科水平上的分度圖Fig.5 Family level division of microorganisms

圖6 腸道微生物在科水平上的熱圖Fig.6 Family level thermogram of microorganisms

由圖5、圖6可知，毛螺菌科（22.55%~20.61%）和擬桿菌科（23.21%~18.62%）主要組成蛋雞腸道中的厚壁菌門。

由表6可知，叢毛單胞菌科（9.32%~2.56%）、莫拉菌科（4.71%~1.09%）和假單胞菌科（5.32%~4.01%）主要組成變形菌門。叢毛單胞菌科和莫拉菌科變化顯著（P＜0.05）；擬桿菌科（23.21%~18.62%）、紫單胞菌科（6.37%~4.58%）和理研菌科（3.98%~1.67%）主要組成擬桿菌門，其豐度有顯著變化（P＜0.05）；疣微菌科（26.31%~17.82%）主要組成疣微菌門，組間豐度有顯著變化（P＜0.05）。

表6 微生態添加劑對腸道微生物群落在科水平上豐度的影響Tab.6 Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at family level 單位：%

2.3.3 微生態添加劑對蛋雞腸道中微生物群落在屬水平上豐度變化的影響（見圖7、圖8、表7）

圖7 腸道微生物在屬水平上的分度圖Fig.7 Genus level of microecological additives

圖8 微生態添加劑腸道微生物在屬水平上的熱圖Fig.8 Genus level of heat map microorganisms

由圖7、圖8可知，擬桿菌屬（Bacteroides）和乳桿菌屬（Lactobacillus）是直腸和盲腸屬水平的優勢菌群。

由表7可知，微生態制劑對蛋雞腸道微生物結構菌群有顯著變化影響的菌屬有擬桿菌屬、不動桿菌屬以及未分類的紫單胞菌賀叢毛單胞菌屬（P＜0.05）。此外還有很多分類位置未定（19.45%~16.31%）和目前數據庫里沒有信息的菌屬（24.17%~21.35%），說明微生態制劑對蛋雞腸道內微生物菌群的影響還有待深入研究。

表7 微生態添加劑對腸道微生物群落屬水平上豐度的影響Tab.7 Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at the level of genera 單位：%

3 討論

3.1 微生態添加劑對蛋雞腸道菌群在門水平上的影響

腸道微生物對蛋雞起著重要作用[7]。本研究通過對不同組的腸道食糜微生物進行測序分析，發現厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門和放線菌門是蛋雞腸道微生物群落在門水平上所含的細菌，與王偉唯[8]對蛋雞腸道功能的測序結果和徐家付[9]的研究中的檢測結果存在差異。王偉唯[8]研究發現，在門水平上組成盲腸微生物有厚壁菌門（32.45%~47.86%）、變形菌門（3.28%~17.56%）、擬桿菌門（38.93%~12.54%）、疣微菌門（3.22%~1.04%）和未分類菌門（19.45%~28.37%）。徐家付[9]研究發現，在門水平上主要由厚壁菌門（51.06%~78.21%）、變形菌門（30.29%~49.32%）和疣微菌門（1.59%~18.75%）組成；對比這些數據在某些菌門豐度上有些許不同。此結果可能是由于不同地區的樣本在個體微生物上存在差異；不同品種和日齡的蛋雞也會出現這種差異[10]。

3.2 微生態添加劑對蛋雞腸道菌群在科和屬水平上的影響

在科和屬水平上，未知菌群的豐度最高可達19.45%和24.17%，表明當前對蛋雞腸道微生物的研究還有待深入探討，很多細分的菌群還未被添加到數據庫中。在科和屬水平上毛螺旋菌科和瘤胃菌科的豐度很高，且在整個添加微生態制劑的試驗中，在蛋雞腸道中基本保持恒定，與羅利龍[11]、石水琴[12]和刑爽[13]相關研究的數據基本相同。

從菌群的門、科、屬豐度熱圖聚類分析結果可知，蛋雞腸道內微生物群落結構的變化會隨著添加微生態制劑而變化，這與攝入的食物有關[14]。Alpha多樣性分析表明，隨著添加微生態制劑蛋雞腸道微生物多樣性會發生變化，但各種微生物之間無顯著差異，說明在給蛋雞添加微生態制劑的時候，蛋雞腸道微生物已經完成定植[15]，但會隨著攝入食物發生改變[16]，與徐家付[9]的報道一致；但與楊梅梅[17]報道的腸道微生物群落多樣性隨著蛋雞腸道微生物結構菌群添加微生態制劑趨于復雜的結果不一致。

本研究揭示了微生態添加劑對蛋雞腸道菌群在門、科、屬水平上的豐度情況，能夠為蛋雞腸道疾病的防治和微生態制劑的開發提供參考。

4 結論

在本試驗條件下，添加微生態制劑能夠提高腸道微生物的豐度，使梭菌族細菌豐度增加，不但可以更多地將有機化合物轉化成機體必需的丙酸、乙酸和微量的丁酸，促進雞的生長發育，增加體重；還可以預防雞感染沙門氏菌，促進蛋雞健康生長。