急性冷暴露對仔豬多器官miR-383表達的影響

吳 優，王曉媛，甄 莉

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江大慶 163000）

miRNA是發現的較晚的一類單鏈小分子非編碼RNA，在植物到動物組織中廣泛存在，在生物的發育、生殖、疾病、細胞凋亡、應激反應等過程中發揮調控作用。miRNA分子很小，僅由20~24個核苷酸組成，通過靶向抑制或降解mRNA在轉錄水平進行基因表達的調控[1]。生物的一切活動均與環境密不可分。低溫作為一種最常見的非生物因素對動、植物生理機能產生直接影響。由低溫引起的冷應激常發生于早春和晚秋季節，尤其是濕度大的天氣，可導致畜禽生長發育遲緩，代謝紊亂，免疫力、生產性能、繁殖性能下降，甚至導致死亡[2]。冷應激研究過程中發現，松鼠、大鼠、蝙蝠、斑馬魚等動物的心臟、骨骼肌、肝臟、脂肪等器官和組織中有多種miRNA與冷應激反應密切相關，如miR-425、miR-483、miR-92b、miR-383等[3-5]。miR-383是miRNA家族的一員，主要參與細胞的氧化損傷、增殖、凋亡等生物進程[6]，其表達失調已在癌癥、不孕不育、神經退行性疾病等多種疾病中得到證實[7-8]。本研究通過qRT-PCR法檢測急性冷暴露仔豬多器官中miR-383的表達量，以明確急性冷暴露是否能夠影響miR-383在組織器官中的表達，從而揭示冷應激反應中miR-383的調控機制，為冷應激的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選取體況相近、健康的斷奶仔豬（30日齡）16頭，隨機分為對照組（NT）和冷暴露組。對照組條件為（24±2）℃，相對濕度40%~50%；冷暴露條件為（4±2）℃，相對濕度40%~50%。冷暴露組又分為3個處理，分別進行2（CE 2 h）、6（CE 6 h）和12 h（CE 12 h）冷暴露，每組4頭仔豬。飼養試驗在人工氣候室內進行。預試7 d后，進行冷暴露試驗。試驗期間自由采食和飲水。

1.2 儀器設備

Nanodrop 2000核酸蛋白定量儀（Thermo Fisher Scientific，美國）、移液器（Eppendorf，德國）、低溫高速離心機（Hitachi，日本）、CFX96熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）、MM400混合型球磨（Retsch，德國）。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 血清中皮質醇（CORT）

冷暴露結束后，股動脈采血，制備血清，凍存于-80℃冰箱，使用豬皮質醇（CORT）ELISA檢測試劑盒（mni.mAbs，美國）檢測CORT含量。

1.3.2 組織中miR-383表達量

冷暴露結束后，將仔豬乙醚麻醉后處死，取肺、小腸、肌肉（背最長?。?、腎、脾和肝組織置于-80℃保存。使用5 min RNA純化試劑盒（B0132，哈爾濱新海基因檢測有限公司）提取總RNA，用反轉錄試劑盒（D0401，哈爾濱新?；驒z測有限公司）制備cDNA。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司根據miRBase中登錄的豬miR-383和U6的基因序列進行設計和合成。miR-383的反轉錄引物和上游序列為：5′-CAGTTGGTCAGCAGTTCTTGG TAT-3′和5′-ACCTCCCACAGCACTGCC-3′；U6的反轉錄引物和上游序列為：5′-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3′和5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。熒光定量檢測利用Fast DNA Probe qPCR Mix（A2301，哈爾濱新?；驒z測有限公司）。反轉錄參數如下：37℃、15 min，85℃、5 s。PCR反應參數如下：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、30 s，40個循環。

1.4 數據統計與分析

數據應用SPSS 19.0進行單因素方差統計分析，結果以“平均值±標準差”表示，采用t檢驗進行組間比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 冷暴露對仔豬CORT含量的影響（見圖1）

由圖1可知，斷奶仔豬血清CORT含量在冷暴露2 h后開始上升，但差異不顯著（P＞0.05）；冷暴露6 h CORT含量持續上升，極顯著高于對照組（P＜0.01）；冷暴露時間延長到12 h，CORT含量迅速回落，與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 冷暴露仔豬血清CORT含量的影響Fig.1 Effect of cold-exposed piglet serum CORT content

2.2 冷暴露對仔豬miR-383表達水平的影響（見圖2）

由圖2可知，冷暴露2 h后，肺和肌肉中miR-383表達量顯著降低（P＜0.05），肝和脾中則顯著升高（P＜0.05）；冷暴露6 h后，肌肉中miR-383表達量持續下降（P＜0.05），肝中繼續上升（P＜0.01），其他器官中miR-383表達量與對照組無顯著差異（P＞0.05），表明冷暴露對肌肉和肝臟中miR-383表達量的影響迅速且穩定；冷暴露12 h后，miR-383表達量在小腸顯著上升（P＜0.05），在腎顯著下降（P＜0.05），脾顯著上升（P＜0.05），肝中仍表現為持續上升（P＜0.01），表明冷暴露對肝臟中miR-383表達量的影響較肌肉中更穩定。由此可以推測，miR-383有可能成為冷應激的臨床診斷標志物，尤其是在肝臟中。

圖2 冷暴露斷奶仔豬組織中miR-383相對表達量的影響Fig.2 Effect of relative expression of miR-383 in cold-exposed weaned piglets

3 討論

在本研究中，對30日齡斷奶仔豬進行冷暴露時采用的溫度是（4±2）℃，冷暴露時間分別設置為2、6、12 h。這一條件的選擇是利用了本實驗室在前期研究工作中建立的仔豬冷暴露模型。模型建立過程中檢測了冷暴露斷奶仔豬動脈血pH值、電解質、血氣參數、多種血清激素，在這些指標檢測結果的基礎上對仔豬機體內環境是否處于穩態進行綜合評價，最終篩選出適宜的冷暴露條件[9]。

在冷暴露條件下，仔豬多器官中miR-383表達量出現顯著變化，尤其是在肌肉和肝臟中，表明其參與了多器官的冷應激反應。有研究表明，在成纖維細胞向神經元的轉化過程中，miR-383水平的上升直接抑制LdhamRAN的表達[10]。Ldha在生物中普遍存在，表達產物為乳酸脫氫酶A，主要大量存在于肌肉組織中，實現將丙酮酸轉化為乳酸，通過促進糖酵解過程起到為肌肉組織迅速供能的作用。當動物處于低溫環境時，呼吸道黏膜和肢體末端的毛細血管發生收縮，從而影響呼吸和循環過程，進而引起血氧濃度下降。本試驗中，冷暴露仔豬肌肉中miR-383表達量下降，可靶向調控Ldha表達量上升，從而加速肌肉組織中丙酮酸的乳酸發酵過程，從而使糖酵解加強，迅速產能，以適應寒冷環境。在肝臟中miR-383可抑制Pfkfb1的表達[11]，Pfkfb1能夠間接激活糖酵解關鍵酶PFK-1，因而仔豬冷暴露后，肝臟中miR-383表達量的上升抑制了糖酵解過程，同時可促進糖和脂肪的有氧氧化，從而適應寒冷環境。

4 結論

本研結果表明，4℃冷暴露6 h可使仔豬處于急性冷應激狀態。從miR-383表達量的角度分析，肺、肌肉、肝和脾對冷刺激響應迅速（2 h），小腸和腎的響應時間較長（12 h），急性冷暴露（2~12 h）可使仔豬肝臟中miR-383表達量持續顯著上升。