二安替比林甲烷比色法測定家禽飼料和糞便中二氧化鈦含量

王少龍，陳志敏，劉國華，常文環(huán)，鄭愛娟，蔡輝益

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081）

二氧化鈦又稱為鈦白粉，分子式為TiO2，是一種質(zhì)地柔軟的白色粉末，具有無毒、穩(wěn)定、分散性好的特性[1]。二氧化鈦?zhàn)鳛楝F(xiàn)行適用的外源指示劑，在豬、雞和牛的消化代謝試驗(yàn)研究中被廣泛應(yīng)用[2-5]。指示劑的回收率和指示劑的分布情況對消化率的測定結(jié)果有較大影響。因此，在應(yīng)用外源指示劑法時(shí)，需要保證指示劑與飼料充分混勻，采集糞樣時(shí)均衡收集[6]。二氧化鈦測定的準(zhǔn)確性決定消化代謝試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，定量檢測二氧化鈦的方法有電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-AES）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和二安替比林甲烷比色法等[7-10]。ICP-AES和ICP-MS方法需要使用大型儀器，且樣品前處理操作復(fù)雜，需要對測定元素進(jìn)行富集處理，這兩種方法操作成本高，對試驗(yàn)人員的專業(yè)水平要求高，難以得到廣泛應(yīng)用。那些不具備大型檢測儀器的實(shí)驗(yàn)室無法應(yīng)用ICP-AES和ICP-MS方法，多采用二安替比林甲烷比色法進(jìn)行測定。

二安替比林甲烷比色法具有測定結(jié)果準(zhǔn)確度高、對儀器設(shè)備的要求不高、簡單易操作的優(yōu)點(diǎn)，適合應(yīng)用推廣。劉超等[11]為探究更加簡捷有效、準(zhǔn)確度高的火鍋底料中二氧化鈦含量測定方法，使用二安替比林甲烷分光光度法測定多種火鍋底料中二氧化鈦含量，得到鈦含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.245 0X+0.000 4，R2=1.000 0。馬嫄等[12]采用二安替比林甲烷分光光度法對幾種休閑零食中二氧化鈦的含量進(jìn)行測定，得到鈦含量標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.251 7X-0.008 0，R2=1.000 0，且鈦含量與吸光度有良好的擬合性。嚴(yán)進(jìn)[13]在原有二安替比林分光光度法測定二氧化鈦的方法基礎(chǔ)上，采用水和異丙醇組成的體系替換單純水相做溶劑，發(fā)現(xiàn)顯色劑溶劑化效應(yīng)增強(qiáng)，顯色反應(yīng)的靈敏度明顯提高。田倫富等[14]使用以二安替比林甲烷為顯色劑的比色法檢測釩基合金中的鈦含量，對鹽酸、抗壞血酸和顯色劑用量優(yōu)化選擇后，發(fā)現(xiàn)回收率為97%~104%。胡嫻鳳等[15]在研究食品中的二氧化鈦含量時(shí)，考慮到二安替比林甲烷分光光度法背景吸收對檢測結(jié)果的干擾，采用在原有試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行一對一扣除本底空白的方式對試驗(yàn)方法優(yōu)化，提高了檢測準(zhǔn)確度。王佳雅等[16]采用二安替比林甲烷比色法和ICP－MS法對小麥粉及其制品中的二氧化鈦含量進(jìn)行測定，探究小麥粉中二氧化鈦的本底值，發(fā)現(xiàn)該方法可以有效改善檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為比色法在小麥粉中測定二氧化鈦含量的技術(shù)優(yōu)化方面提供參考。

本研究參照GB 5009.246—2016《食品中二氧化鈦的測定》中的第二法“二安替比林甲烷分光光度法”[17]，以飼料和糞便為檢驗(yàn)對象，對家禽代謝試驗(yàn)中二氧化鈦的測定進(jìn)行分析，旨在建立家禽代謝試驗(yàn)中飼料和糞便中易于推廣的二氧化鈦檢測方法，為快速準(zhǔn)確地測定養(yǎng)分表觀消化率提供參考。

1 材料與方法

1.1 測定原理

待測樣品經(jīng)過混合強(qiáng)酸的水解，鈦與二安替比林甲烷反應(yīng)生成黃顏色的絡(luò)合物，一定的濃度范圍、420 nm波長條件下，樣品中的鈦含量與吸光度呈線性關(guān)系，可以依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量求出對應(yīng)吸光度下的鈦含量。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試劑

高氯酸、濃硫酸、濃硝酸、濃鹽酸、硫酸銨、抗壞血酸、二安替比林甲烷、鈦標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 g/L）

1.2.1.1 混合酸的配制

量取1份高氯酸與9份濃硝酸，充分混合，裝瓶備用。

1.2.1.2 鹽酸（1+1）的配制

量取100 mL濃鹽酸，將濃鹽緩慢加入100 mL蒸餾水中，充分混合，裝瓶備用。

1.2.1.3 鹽酸（1+23）的配制

量取10 mL濃鹽酸，將濃鹽酸緩慢加入230 mL蒸餾水中，充分混合，裝瓶備用。

1.2.1.4 2%硫酸（體積分?jǐn)?shù)）的配制

量取2 mL濃硫酸，將濃硫酸緩慢加入98 mL蒸餾水中，充分混合，裝瓶備用。

1.2.1.5 抗壞血酸溶液（2%）的配制

準(zhǔn)確稱取2 g抗壞血酸，利用少量蒸餾水溶解抗壞血酸，蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，現(xiàn)配現(xiàn)使。

1.2.1.6 二安替比林甲烷溶液（5%）的配制

準(zhǔn)確稱取5 g二安替比林甲烷，以（1+23）鹽酸為溶劑，溶解并稀釋定容至100 mL容量瓶中，搖勻，裝瓶備用。

1.2.1.7 鈦標(biāo)準(zhǔn)液的配制

利用移液槍準(zhǔn)確移取1 mL鈦標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL容量瓶中，使用2%硫酸稀釋定容至刻度線，搖勻，裝瓶備用。

1.2.2 儀器設(shè)備

分光光度計(jì)、電熱板、分析天平（感量為0.1 mg）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取鈦標(biāo)準(zhǔn)液0、0.5、2.5、5.0、10.0 mL于50 mL的容量瓶中。向容量瓶中加入5 mL 2%抗壞血酸溶液，充分混合，依次加入14 mL（1+1）鹽酸、6 mL 5%二安替比林甲烷溶液，蒸餾水定容至刻度線，充分混合，靜置40 min，上機(jī)比色。以上配置的標(biāo)準(zhǔn)工作液中鈦的濃度依次為0、0.1、0.5、1.0、2.0 g/L。分別取部分以上待測液于1 cm比色杯，在420 nm波長條件下讀吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)工作液的鈦濃度為橫坐標(biāo)、對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，制作鈦含量與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試樣消解

首先使用分析天平準(zhǔn)確稱取樣品（飼料2 g，食糜、糞便樣品0.5 g，精確至0.001 g）置于高腳燒杯中，向燒杯中注入5~10 mL的混合酸，放置在加熱板上，蓋好表面皿，調(diào)整加熱板溫度保持微沸，水解至紅棕色煙霧散盡、樣品徹底消解溶液澄清；待以上液體冷卻，向燒杯中加入1 g硫酸銨和5 mL濃硫酸，煮沸至白色煙霧散盡溶液澄清即可，取下冷卻；將消解液有效成分完全轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，使用蒸餾水仔細(xì)沖洗表面皿和燒杯壁，定容至容量瓶刻度線，充分混合，留作備用。

1.4.2 待測樣消解液顯色

使用移液槍移取5 mL待測樣消解液，注入50 mL容量瓶中，其余步驟同1.3。

1.4.3 比色

以5 mL蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)工作液，其余試劑均按1.3要求正常添加的溶液為參比溶液，取1 cm比色杯，在波長420 nm的條件下，利用分光光度計(jì)測定顯色后標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測樣溶液的吸光度。

1.4.4 二氧化鈦含量的計(jì)算公式

二氧化鈦含量計(jì)算公式如下：

式中：TiO2為待測樣中TiO2含量（mg/kg）；Ti為標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的待測樣中的鈦濃度（μg/kg）；100為待測樣消解后定容的總體積（mL）；50為顯色后待測樣定容的總體積（mL）；m為稱取待測樣的質(zhì)量（g）；5為顯色后移取待測樣溶液的總體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈦濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）

由圖1可知，鈦濃度與吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=3.946 1X，R2=1.000 0。相關(guān)系數(shù)R2等于1，表明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程擬合度很好，鈦濃度與吸光值之間有著很強(qiáng)的線性相關(guān)性。

圖1 鈦濃度測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for titanium concentration determination

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

按試驗(yàn)方法對肉雞代謝試驗(yàn)的飼料、糞便樣品平行測定10次，飼料樣品中二氧化鈦的平均測定值為3 926.44 mg/kg，測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）為4.25%；糞便樣品中二氧化鈦的平均測定值為13 632.60 mg/kg，測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=10）為3.70%。兩種樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)值均在5%以內(nèi)，表示二安替比林甲烷比色法的精密度達(dá)到檢測要求，得出的試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.3 回收試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

由表2可知，飼料中二氧化鈦的回收率為100.14%，糞便中二氧化鈦的平均回收率為98.14%，表明二安替比林甲烷比色法達(dá)到檢測要求。該方法所需儀器設(shè)備大多數(shù)試驗(yàn)室都能滿足，樣品前處理簡便、快速，試驗(yàn)結(jié)果回收率高、重復(fù)性好，可用于代謝試驗(yàn)中樣品的檢驗(yàn)。

表2 飼料和糞便中二氧化鈦回收率Tab.2 Recovery rate of titanium dioxide in feed and feces

3 討論

在樣品檢測中，以下幾個(gè)方面對準(zhǔn)確的測定二氧化鈦的含量至關(guān)重要：（1）樣品的稱量一定要準(zhǔn)確，精確到小數(shù)點(diǎn)后三位；（2）消解要徹底，電熱板的消解溫度設(shè)定在250~350℃，如果消解溫度不夠，容易產(chǎn)生白色沉淀，影響測定結(jié)果；（3）定容時(shí)，凹液面與刻度線相平，否則會(huì)引入不確定度；（4）保證完全轉(zhuǎn)移消解液，對燒杯壁和表面皿上殘留有效成分進(jìn)行沖洗一并轉(zhuǎn)移，避免消解液遺失而導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。

夏輝等[18]采取微波消解法處理試樣，利用過氧化氫比色法定量測定小麥粉中二氧化鈦含量，測得7個(gè)處理組二氧化鈦含量的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.88%，回收試驗(yàn)中二氧化鈦加標(biāo)回收率范圍在92%~98%之間。鄧雪娟等[19]研究過氧化氫比色法對家禽飼料和食糜中二氧化鈦含量的測定，在回收試驗(yàn)中測得二氧化鈦平均回收率為97.35%。結(jié)合本試驗(yàn)研究結(jié)果，測定值相對標(biāo)準(zhǔn)差均在5%以內(nèi)，加標(biāo)平均回收率均高于98%。因此，二安替比林甲烷比色法適用于家禽代謝試驗(yàn)中二氧化鈦含量的測定。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，高氯酸與硝酸為體系的混合酸消解飼料和糞便樣品的效果良好，以二安替比林甲烷為顯色劑的分光光度法去定量測定二氧化鈦時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果精密度高、加標(biāo)回收率高。二安替比林甲烷比色法是一種操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確的測定方法，適合在家禽代謝試驗(yàn)中推廣應(yīng)用。