低強度交變電磁場對于丙泊酚誘發老年大鼠認知功能衰退的治療作用研究

高 敏，劉文雄

（西安市西電集團醫院麻醉科，西安710077）

0 引言

丙泊酚是臨床上最為常用的麻醉劑之一，其主要通過激活γ-氨基丁酸受體氯離子通道復合物發揮鎮靜催眠作用。丙泊酚被廣泛用于重癥監護病房危重患者的麻醉誘導、麻醉維持和鎮靜[1]。丙泊酚具有起效快、誘導平穩、恢復快、功能恢復完全、術后惡心嘔吐發生率低等優點[2]。然而，患者經丙泊酚麻醉后也常發生認知功能障礙[3]，該現象尤其在中老年的手術患者中更為常見且嚴重[4-5]。低強度交變電磁場（electromagnetic fields，EMF）治療作為一種經濟、安全、無創的物理因子作用手段，已得到廣泛的臨床應用[6]。已有研究表明，低強度交變EMF對于生物體的認知功能具有明顯的改善作用[7-8]。目前，有關應用低強度交變EMF減輕麻醉后認知功能障礙研究的報道較少。本研究探討低強度交變EMF對于麻醉后大鼠認知功能恢復的影響并探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Morris水迷宮，上海移數信息科技有限公司；電磁場刺激裝置及實驗大鼠有機玻璃籠（電磁場研究專用），課題組自制；高精度病理切片機（RM 2016），德國徠卡公司；激光掃描共聚焦顯微鏡（FV1200），日本奧林巴斯公司；雙垂直電泳儀（DYCZ-24DN），北京六一儀器廠；酶標檢測儀（Rt2100c），美國Rayto公司；凝膠成像系統（Gel Doc XR+），美國Bio-Rad公司；半干轉膜儀（Trans-Blot SD System），美國Bio-Rad公司；丙泊酚注射液，西安立邦制藥有限公司；ELISA試劑盒，武漢華美生物公司；B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，美國Abcam公司；戊巴比妥鈉，美國Sigma公司；脫氧核糖核酸轉移酶介導的缺口末端標記法（TdT-me-diated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡熒光檢測試劑盒，美國Abcam公司。

1.2 實驗動物與實驗分組

將36只清潔級健康Sprague-Dawley大鼠（20月齡，雄性，體質量400~420 g，購于成都達碩實驗動物有限公司）隨機分為對照組、丙泊酚組和丙泊酚+EMF組，每組12只。對照組于第1天腹腔注射生理鹽水（5 mL/d），丙泊酚組和丙泊酚+EMF組腹腔注射丙泊酚，首次注射劑量為60 mg/kg，隨后每小時注射1次（第二次及以后的注射劑量為首次劑量的一半，即30 mg/kg），共注射6次，即可維持麻醉狀態6 h。每次麻醉后大鼠立即平臥在自制的吸氧箱上，以5 L/min的流量持續供氧，待翻正反射恢復后，將大鼠從吸氧箱中取出。除實驗時間外，大鼠可以自由進食和飲水。丙泊酚+EMF組大鼠每天進行6 h的全身性EMF暴露，治療第7天結束。本研究嚴格按照美國國立衛生研究院實驗室動物護理和使用指南中的建議進行。

1.3 低強度交變EMF治療裝置

低頻、低強度電磁場治療系統由電磁場發生模塊和Helmholtz線圈輸出模塊構成。電磁場發生模塊由MSP430單片機作為控制核心，輸出產生頻率、強度線性可調的低強度正弦交變電磁信號，該信號經過系統內部整合的信號調制、整合、濾波、放大處理后，將電流輸出至Helmholtz線圈模塊中。Helmholtz線圈模塊中包含有2個直徑相同（40 cm）且等軸放置的線圈組，線圈匝數為100，線圈間距為20 cm。實驗所產生的交變電磁場峰值強度為5 mT，頻率為50 Hz。實驗過程中確保大鼠實驗籠底部與線圈中軸線在一個平面上，以保證電磁場分布的均勻穩定。

1.4 學習記憶功能測試

治療結束后，采用Morris水迷宮測試3組大鼠的學習記憶功能。實驗前，將平臺放置在水迷宮東北象限的中心，高度在水面以下2 cm處。在用于水迷宮實驗的水池里加入適量的墨水，使大鼠無法分辨平臺。在用于水迷宮實驗的水池的墻上掛著幾個物體作為參考。將水溫加熱至24～26℃，進行定位導航試驗5 d。每天分為2個時段，每時段進行4次訓練。在4次訓練中，將大鼠分別置于不同象限的水中。用秒表記錄大鼠找到平臺前的持續時間（逃逸潛伏期）。2次訓練間隔1 min。第5天下午進行探索實驗。平臺被移走，所有大鼠被從西南象限放入水中，使用Morris水迷宮系統自帶的攝像機和分析軟件記錄和量化大鼠在水迷宮中2 min內的游動路徑的距離（游泳距離）和穿越平臺次數。

1.5 血清淀粉樣β蛋白（Aβ）和神經元特異性烯醇化酶（NSE）檢測

水迷宮實驗結束后，使用過量戊巴比妥鈉（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈取血3 mL，以3 000 r/min離心5 min，-20℃保存血清。采用酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清Aβ和NSE的表達水平。該過程嚴格按照試劑盒中的說明標注的操作步驟進行。

1.6 海馬組織神經營養因子的檢測

大鼠開顱后取腦取、海馬組織。將海馬組織等分為3份，分別用于ELISA、組織切片染色和蛋白質印跡法檢測。用生理鹽水（1∶10）快速制備勻漿，3 000 r/min離心10 min，獲得上清液。采用ELISA法檢測神經生長因子（NGF）和腦源性神經營養因子（BDNF）的表達水平。該過程嚴格按照試劑盒中的說明標注的操作步驟進行。

1.7 海馬組織TUNEL熒光染色

對提取的大鼠海馬組織先進行4%多聚甲醛固定，再進行石蠟包埋，包埋后利用高精度病理切片機進行組織切片，然后使用二甲苯和梯度酒精脫蠟。脫蠟后用TUNEL工作液孵育組織切片（37℃避光1 h），隨后進行4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染細胞核（37℃避光1 h），最后對樣本進行封片，封片后在激光掃描共聚焦顯微鏡下進行圖像采集和分析。

1.8 海馬組織凋亡因子的蛋白質印跡法檢測

先將海馬組織在玻璃研磨機中研磨成分散的細胞，隨后向樣本中加入1 mL細胞裂解液保持30 min，然后以2 000 r/min離心5 min，獲得上清液，使用二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）對蛋白表達水平進行定量檢測。隨后以4∶1的比例上樣，煮沸后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），轉膜及封閉后，分別使用抗凋亡基因Bcl-2和凋亡標志物Caspase-3的一抗進行過夜孵育，充分漂洗后隨后孵育二抗，最后進行顯影和半定量分析。GAPDH抗體作為內參照物。

1.9 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。數據以xˉ±s表示，3組的全部實驗數據采用單因素方差分析與Benferoni post-hoc檢驗結合法進行分析比較。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 低強度交變EMF治療對于丙泊酚誘發的認知功能障礙大鼠學習記憶能力的影響

通過水迷宮實驗檢測3組大鼠學習記憶能力的實驗結果比較見表1。丙泊酚組大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離均顯著高于對照組（P<0.05），而穿越平臺次數顯著低于對照組（P<0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+EMF組大鼠的逃逸潛伏期和游泳距離顯著減少（P<0.05），而穿越平臺次數顯著增加（P<0.05）。對照組與丙泊酚+EMF組大鼠在逃逸潛伏期、游泳距離和穿越平臺次數上均無統計學差異（P>0.05）。

表1 3組大鼠學習記憶能力的實驗結果比較

2.2 低強度交變EMF治療對于丙泊酚誘發的認知功能障礙大鼠血清Aβ和NSE表達水平的影響

通過ELISA法檢測得到的3組大鼠血清Aβ和NSE表達水平的實驗結果比較見表2。丙泊酚組大鼠的血清Aβ、NSE表達水平均顯著高于對照組（P<0.05）；相比于丙泊酚組，丙泊酚+EMF組大鼠的血清Aβ、NSE的表達水平均顯著降低（P<0.05）。對照組與丙泊酚+EMF組大鼠的血清Aβ、NSE表達水平比較均無統計學差異（P>0.05）。

表2 3組大鼠血清Aβ和NSE表達水平的實驗結果比較

2.3 低強度交變EMF治療對于丙泊酚誘發的認知功能障礙大鼠海馬組織中NGF和BDNF表達水平的影響

通過ELISA法檢測得到的3組大鼠海馬組織中NGF和BDNF表達水平的實驗結果比較見表3。與對照組相比，丙泊酚組大鼠海馬組織中NGF和BDNF的表達水平均顯著降低（P<0.05）；而丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中NGF和BDNF的表達水平均顯著高于丙泊酚組大鼠（P<0.05）。對照組與丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中的NGF和BDNF表達水平比較均無統計學差異（P>0.05）。

表3 3組大鼠海馬組織中NGF和BDNF表達水平的實驗結果比較

2.4 低強度交變EMF治療對于丙泊酚誘發的認知功能障礙大鼠海馬組織細胞凋亡的影響

基于TUNEL免疫熒光染色對3組實驗大鼠海馬組織細胞凋亡情況的檢測結果如圖1所示。與對照組相比，丙泊酚組大鼠海馬組織中細胞的凋亡數量明顯增加；而丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中細胞的凋亡數量顯著少于丙泊酚組大鼠。通過蛋白質印跡法對3組大鼠海馬組織細胞凋亡標志物的檢測結果如圖2所示。丙泊酚組大鼠海馬組織中的抗凋亡因子Bcl-2的表達水平顯著低于對照組（P<0.05），而凋亡標記物Caspase-3的表達水平顯著高于對照組（P<0.05）；與丙泊酚組相比，丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中的Bcl-2表達水平顯著升高（P<0.05），而Caspase-3表達水平顯著降低（P<0.05）。對照組與丙泊酚+EMF組大鼠海馬組織中的Bcl-2和Caspase-3表達水平比較無統計學差異（P>0.05）。

圖1 基于TUNEL免疫熒光染色評價3組實驗大鼠海馬組織細胞凋亡情況（圖中比例尺為50μm）

圖2 基于蛋白質印跡法對3組大鼠海馬組織細胞凋亡標志物的檢測結果

3 討論

作為一種無創、經濟、安全的物理因子干預方法，低強度交變EMF已廣泛應用于骨骼肌和軟組織損傷修復、疼痛緩解、炎癥抑制等臨床治療[9]。近年來，低強度交變EMF對神經系統的調控作用也得到了研究者們的廣泛關注[10-12]，有新的證據支持低強度交變EMF在治療包括癡呆癥在內的各種神經疾病方面的生物學效應[11]。而低強度交變EMF對于認知功能的積極作用效果也有一系列的文獻報道[13-14]。學者們通過大量的行為研究發現了低強度交變EMF可以影響人類和動物的認知和記憶功能[7-8]。但是，低強度交變EMF是否能夠對麻醉后認知功能障礙產生積極的作用效果，目前國內外尚未見研究報道。

丙泊酚是臨床上應用最廣泛的靜脈麻醉劑之一，該藥具有療效快、作用時間短、清除快、不良反應少等優點，具有重要的應用價值。然而，已有研究證實丙泊酚抑制海馬的長期增強，而海馬是記憶和學習的基礎[15]。此外，丙泊酚還可以影響人腦中的許多正常神經遞質，這可能導致患者術后認知功能障礙。而研究也發現，丙泊酚對于兒童和老年人的認知功能損傷更為明顯[16]。本研究中，水迷宮實驗結果顯示，經丙泊酚麻醉的大鼠逃逸潛伏期和游泳距離顯著升高，而穿越平臺次數顯著降低，提示經過6 h丙泊酚注射的大鼠在7 d后的學習認知能力顯著降低，提示丙泊酚誘發的老年性認知損傷模型構建成功。而本研究也發現，6 h/d的低強度交變EMF治療能夠顯著減少大鼠逃逸潛伏期和游泳距離，并增加其穿越平臺的次數，提示丙泊酚麻醉劑應用后進行低強度交變EMF干預能夠改善老年大鼠的學習認知功能。

血清Aβ是神經系統損傷和持續炎癥反應的潛在標志之一。學者們的研究發現，麻醉所誘發的認知功能障礙與血清Aβ的表達有關[17]。而血清Aβ濃度的變化可間接反映蛋白印跡法Aβ在腦組織中的聚集情況。NSE是糖酵解過程中烯醇化酶的一種同工酶，它在神經元和神經內分泌細胞中特異性分布，是神經元的特異性標記物[18]。正常情況下，腦脊液和血清中有少量NSE；當患者發生腦缺血、缺氧、中毒或外傷時，神經細胞膜完整性受損，血腦屏障通透性增加，NSE蛋白滲漏到血清或腦脊液中，導致含量增加[19]。本研究結果表明，與對照組相比，丙泊酚組大鼠血清Aβ和NSE表達水平顯著升高；而與丙泊酚組比較，丙泊酚+EMF組大鼠血清Aβ和NSE表達水平均顯著降低。提示低強度交變EMF治療緩解麻醉后認知功能障礙的機制可能與其降低體內血清Aβ和NSE表達水平有關。

神經營養因子是在神經組織中發揮特殊作用的小分子多肽因子，其能促進中樞神經系統發育過程中神經細胞的增殖、生長、分化和存活，調節突觸的可塑性。NGF和BDNF是最重要的神經營養因子。NGF與特定的TrkA受體結合，激活細胞代謝，進而促進神經細胞的增殖和分化，調節中樞和外周神經細胞的存活和軸突的生長，從而在神經細胞損傷的修復中起著非常重要的作用[20]。BDNF通過結合其特異性高親和力受體TrkB發揮神經營養作用。研究發現，NGF和BDNF在改善認知功能方面起著重要作用，它們能提高阿爾茨海默病大鼠的學習記憶能力，促進神經元生長[21]。本研究發現，丙泊酚誘發大鼠海馬組織中NGF和BDNF表達水平顯著降低，而低強度交變EMF治療能夠有效提升丙泊酚注射大鼠海馬組織中NGF和BDNF的表達水平，提示低強度交變EMF對于丙泊酚誘發的認知功能障礙的改善效應與海馬組織中增加的NGF和BDNF表達水平相關。

海馬組織中細胞凋亡的增加是造成認知功能損傷的關鍵因素[22]。而Bcl-2能夠抑制線粒體中的細胞色素C的釋放，阻斷其下游的信號級聯反應，抑制Caspase-3的活化，從而抑制細胞凋亡。本研究TUNEL染色結果發現，丙泊酚組大鼠海馬組織中凋亡顯著高于對照組；而蛋白質印跡法檢測結果進一步揭示丙泊酚大鼠海馬組織中的Bcl-2表達水平顯著降低而Caspase-3表達水平顯著升高，進一步證實了丙泊酚能夠誘導海馬組織的細胞凋亡，這與前人的研究結果一致[23]。本研究結果進一步發現，低強度交變EMF治療能夠顯著降低丙泊酚注射的大鼠海馬組織中凋亡細胞的數量，并且其也能夠顯著提升丙泊酚大鼠海馬組織中Bcl-2的表達水平并抑制Caspase-3蛋白表達。本研究結果表明，低強度交變EMF治療能夠顯著緩解丙泊酚誘發的認知功能障礙大鼠海馬組織的細胞凋亡。

綜上所述，本研究發現低強度交變EMF治療能夠顯著改善丙泊酚誘發的大鼠認知功能障礙，其機制可能與其對細胞凋亡的調控、血清Aβ和NSE表達水平的降低以及NGF和BDNF的表達水平升高有關。后續的實驗將主要關注對于低強度交變EMF治療調節認知功能障礙窗口參數的探討，并通過體外及在體基因沉默技術進一步揭示低強度交變EMF改善認知功能障礙的分子信號機制。