低溫脅迫對木薯‘F200’幼苗葉片亞顯微結構及其葉綠素熒光參數變化的影響

王馨 易拓 朱杰輝 宋勇

摘? 要：為探究低溫脅迫對木薯顯微結構和光合效率的影響，對木薯耐寒品種‘F200和常栽低溫敏感型品種‘華南8號（‘SC8）在人工低溫條件下進行4 ℃低溫處理，觀察處理前和處理3、6、12、24 h下幼苗葉片的掃描電鏡、透射電鏡及葉綠素熒光參數變化情況，并比較兩品種間的差異。結果表明：（1）與‘SC8相比，隨著氣溫的降低‘F200的葉片氣孔會逐漸關閉且葉片蠟質形成自我保護機制;（2）低溫脅迫狀態24 h后，‘F200葉肉細胞內細胞器仍維持工作狀態，而‘SC8葉肉細胞基本死亡;（3）2個品種最大葉綠素熒光強度下降且達到最大熒光所需時間均增加，‘F200的最大熒光值高于‘SC8;（4）低溫脅迫下，‘F200的各項葉綠素熒光參數應急反應強度低于‘SC8，說明‘F200對于在低溫逆境環境中生長的能力強于‘SC8。

關鍵詞：木薯;低溫;顯微;葉綠素熒光

中圖分類號：S533????? 文獻標識碼：A

Effect of Low Temperature Stress on Leaf Submicroscopic Structure and Chlorophyll Fluorescence Parameters of Cassava ‘F200 Seedlings

WANG Xin1， YI Tuo1， ZHU Jiehui1，5*， SONG Yong1，2，3，4*

1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 2. Potato Center of Hunan Province， Changsha， Hunan 410128， China; 3. Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Creation and New Variety Breeding， Ministry of Education， Changsha， Hunan 410128， China; 4. Key Labortory for Vegetable Biology of Hunan Province， Changsha， Hunan 410128， China; 5. Orient Science &Technology College of Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China

Abstract： In order to investigate the effects of low temperature stress on the microstructure and photosynthetic efficiency of cassava， cold resistant cassava variety ‘F200 and low-temperature sensitive cassava variety ‘Huanan 8 （‘SC8） were treated at 4 ℃ under artificial low temperature condition. Scanning electron microscopy （SEM）， transmission electron microscopy （TEM） and chlorophyll fluorescence parameters were observed before and after 3 h， 6 h， 12 h and 24 h treatment， and the differences between the two varieties were compared. The results showed that： Compared with ‘SC8， with the decrease of air temperature， the stomata of ‘F200 leaves gradually closed and the wax in leaves formed a self-protection mechanism. After 24 h of low temperature stress， the organelles in ‘F200 mesophyll cells maintained functioning， while the mesophyll cells of ‘SC8 basically died. The maximum chlorophyll fluorescence intensity of the two cultivars decreased and the time required to reach the maximum fluorescence increased. The maximum fluorescence value of ‘F200 was higher than that of ‘SC8. Under low temperature stress， the emergency response intensity of various chlorophyll fluorescence parameters of ‘F200 was lower than that of ‘SC8， indicating that ‘F200 had a stronger ability to grow in low temperature adversity environment than ‘SC8.

Keywords： cassava; low temperature; microscopy; chlorophyll

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.015

木薯（Manihot esculenta Crantz）大戟科植物[1]，適宜生長在平均溫度約為18 ℃以上且全年無霜期最低8個月的地區，當氣溫低于15 ℃時生長發育逐漸受到抑制，溫度低于4 ℃便停止生長[2-3]。中國完全適合木薯生長的地區較少，為擴大木薯的種植面積，保證我國的糧食安全，國家陸續多次出臺相關政策，例如：“木薯北移”戰略，將湖南等多省份作為適宜木薯種植的北移區域[4]。

不同環境下葉片相應的形態和結構會發生不同的變化[5]。低溫的狀態下葉片中的細胞器和膜結構反應尤為明顯[6]。氣孔作為植物與外界進行氣體交換和水汽蒸騰的通道與葉片正常的功能運轉有著密切的聯系[7]。葉綠素對低溫較敏感，其含量直接影響光合作用效率和光合產物的合成[8]。葉綠素熒光有著廣泛的研究，作為光合作用研究的探針，可以用來檢測植物光合作用受環境的影響程度[9]。葉綠素熒光技術可以靈敏地探測外界環境因子對植物光合作用造成的影響，在植物逆境研究方面顯示出較好的應用前景[10]。快速葉綠素熒光誘導動力學曲線是一種快速獲得PSⅡ光化學活性、電子傳遞和光合器官結構和狀態等信息的方法[11]。Strasser等[12]在生物膜能量流動的基礎上，建立了針對快速葉綠素熒光誘導曲線的數據分析和處理方法，并通過計算能量流和能量比率衡量在給定物理狀態下樣品內部變化，建立了高度簡化的能量流動模型圖。這些能量包括ABS（吸收的光能）、TR（捕捉的光能）、ET（電子傳遞）、DI（熱耗散）[11，13]。

湖南等地的年平均氣溫較低，對木薯的正常生長有或多或少的抑制，本研究在人工氣候室模擬湖南的溫度進行試驗，以木薯‘SC8為對照，研究木薯耐寒品種‘F200在低溫狀態下的葉片結構及葉綠素熒光參數，旨在揭示木薯耐低溫機制在形態結構上的理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試材料? 試驗材料木薯品種‘F200以及對照材料木薯品種‘華南8號均來自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所。

1.1.2? 材料處理? 試驗時間為2019年7月，試驗地點：湖南農業大學園藝學院實驗中心人工氣候室，試驗品種：‘F200和‘華南8號，截取15 cm左右長度的木薯莖段，選取芽點完好且粗細和重量一致的莖段各70根，在直徑17 cm的育苗盆中基質培養。放入FYS-1010W型室內高照度人工氣候室中培養60 d（白天溫度/光強：28 ℃/7500 lx，晚上22 ℃/0 lx），當木薯長到7～8片葉片后，2個品種各取生長勢一致的木薯30株進行（4±1） ℃處理0、3、6、12、24 h，28 ℃為對照。葉綠素熒光試驗葉片和取樣葉片均為從基部向上第三片成熟葉，進行掃描電鏡和透射電鏡的試驗。

1.2? 方法

掃描電鏡方法[14]觀察木薯葉片表面顯微結構，透射電鏡方法[15]觀察木薯葉片細胞超微結構，葉綠素熒光方法[16]用Fluorpen便攜式葉綠素熒光儀測定各處理的木薯苗功能葉片的葉綠素熒光動力學曲線（OJIP）和非光化學淬滅曲線（NPQ）。

2? 結果與分析

2.1? 常溫下木薯葉表面顯微結構

‘F200和‘華南8號成熟葉片在結構上有一定的差異，如圖1所示，2個品種木薯的下表皮氣孔分布為規則型，氣孔下陷形成氣孔窩，氣孔器均為長橢圓形，表面蠟被和表茸毛十分豐富。如圖1A、圖1B所示，在相同面積、相同放大倍數的情況下，‘F200的木薯葉片氣孔密度比‘華南8號的大，且‘F200的氣孔周圍的蠟被和葉片表面的茸毛更豐富，如圖1C、圖1D所示。

2.2? 低溫脅迫下不同木薯葉片氣孔開閉情況

王穎等[17]的研究表明，溫度對氣孔的開放率有顯著影響，在其他條件相同的情況下，隨著溫度的降低，植物氣孔開放也呈現下降的趨勢。如圖2所示，放大5000倍，在常溫情況下，‘F200氣孔周圍密布著絮狀、松針狀蠟質，氣孔處于張開狀態，低溫脅迫3 h，氣孔關閉，氣孔周圍的蠟質晶體熔融成片，覆蓋在氣孔口，這在一定程度上起到了阻隔低溫的作用，同時減少水分損失，低溫脅迫6、12、24 h，氣孔仍保持關閉狀態，氣孔周圍的蠟質由成片熔融狀變為小樹枝狀再變為松針狀。如圖3所示，放大5000倍，在常溫情況下，‘華南8號氣孔張開，周圍蠟質呈絮狀，脅迫3、6、12、24 h、后，‘華南8號木薯氣孔依舊張開，但隨著時間的增加，開度逐漸減小，表面蠟質由絮狀變為小樹枝狀再熔融成片狀。

2.3? 常溫下木薯葉片細胞超微結構

透射電鏡下木薯葉片細胞常溫超微結構如圖4所示，常溫下，細胞內結構完整，葉綠體緊貼細胞質膜，呈梭型在細胞多處分布，葉綠體基粒片層垛疊清晰可見，呈平行排列，葉綠體內有少量質體小球和淀粉粒，線粒體在葉綠體周圍分布，細胞核完整，核膜清晰可見，高爾基體的雙層膜清晰可見，在高爾基體旁有合成的蛋白質顆粒，液泡占據細胞內大部分空間，將細胞器擠向四周，液泡內還有其他小顆粒物質。

2.4? 低溫脅迫下木薯葉片細胞超微結構

如圖5，‘F200中A所示，低溫脅迫3 h后，‘F200木薯葉肉細胞結構完整，細胞壁結構清晰完整。葉綠體與原生質膜出現小間隙，葉綠體的基粒片層較常溫下有些溶解，合成的淀粉粒增加，質體小球數目也有所上升。開始出現細胞間隙，高爾基體和線粒體變得模糊，核膜不再清晰可見，液泡的界線不明顯。與‘F200相比（‘SC8圖A）處理3 h后，‘華南8號木薯葉片葉綠體中質體小球數量和體積都超過‘F200，能夠看到清晰的液泡膜，同時細胞核膜有降解的現象。低溫脅迫6 h后，如圖‘F200B所示，細胞間隙繼續擴大，有輕微的質壁分離現象，葉綠體與原生質體的間隙消失，葉綠體的基粒層垛疊結構能較清晰的識別，葉綠體內的質體小球數目明顯減少，液泡內蛋白質、淀粉等滲透物質增加。反觀‘華南8號（圖‘SC8 B），‘華南8號葉肉細胞間的間隙明顯增大，幾乎見不到葉綠體的基粒層，葉綠體內的質體小球數目幾乎占據了整個葉綠體，未見到較大體積的蛋白質和淀粉顆粒，細胞質內較混沌，細胞核縮小。低溫脅迫12 h后，如圖‘F200C所示，細胞間的間隙繼續擴大，細胞結構完整，細胞體積逐漸減小，葉綠體內幾乎見不到基粒片層，葉綠體內有一些質體小球和較多明顯可見的淀粉顆粒，液泡內蛋白質等滲透物質較多，細胞核縮小。處理12 h后，‘華南8號（圖‘SC8C）葉肉細胞間隙增大，質壁分離現象較為明顯，葉綠體內的基粒片層溶解，葉綠體內合成淀粉顆粒，仍有較多的質體小球存在于葉綠體內，細胞核從內至外開始緩慢溶解。處理24 h后，如圖‘F200D所示，葉肉細胞之間有著明顯的間隙，葉綠體內基本見不到基粒片層，同時，葉綠體內的淀粉合成仍在繼續，質體小球體積，數目增加，液泡內的滲透物質明顯增加，細胞體積繼續縮小。如圖‘SC8D所示，處理24 h后，‘華南8號葉肉細胞細胞壁出現破損的傷口，細胞內的葉綠體內沒有合成淀粉，細胞液內滲透物質較少，找不出明顯的細胞核結構，細胞幾乎處于“死亡”狀態。

2.5? 低溫脅迫對木薯幼苗快速葉綠素熒光誘導動力曲線的影響

采用Fluorpen便攜式葉綠素熒光儀測量木薯葉片葉綠素熒光快速誘導動力學曲線。如圖6所示，FK、FJ和FI分別是300 μs、1 ms和30 ms時的熒光強度，Fm=FP即最大熒光強度。常溫情況下、‘F200（CK）和‘華南8號木薯葉片的OJIP曲線基本重合，4 ℃低溫脅迫下，OJIP曲線發生形變，2個品種最大葉綠素熒光強度下降，‘F200的最大熒光高于‘華南8號，同達到最大熒光所需時間增加。

2.6? 低溫脅迫對木薯幼苗葉綠素熒光參數的影響

采用Strasser等[18]的方法計算以下熒光參數。以有活性的反應中心（RC）為基礎，在受到低溫等逆境脅迫時，單位有活性反應中心吸收的光能（ABS/RC）、捕獲的光能（TRo/RC）和熱耗散的光能（DIo/RC）顯著增加，用于電子傳遞的能量（ETo/TRo）明顯減小，葉片通過減少電子傳遞所耗能量份額，增加熱耗散的能量份額以減少低溫等逆境引起的傷害。如表1所示，低溫脅迫下，‘華南8號木薯葉綠素熒光參數：ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC均顯著增加，ETo/TRo顯著減小;而‘F200木薯葉綠素熒光參數：ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC三者增加速度和幅度遠小于‘華南8號，ETo/TRo減小程度小于‘華南8號。

低溫脅迫下，‘華南8號木薯葉片中電子傳遞到下游電子受體的概率φo、電子傳遞所需的量子產額φEo和PSⅠ受體側末端電子受體的量子產額φRo均隨著脅迫時間的增加大幅減小，熱耗散的量子比率φDo大幅度上升，這說明低溫脅迫嚴重抑制了其電子傳遞，使得光反應活性和PSⅠ的相對活性顯著下降。反觀‘F200木薯在低溫脅迫下對其φo、φEo、φRo三個葉綠素熒光參數的影響程度弱，能夠較好地維持其正常的電子傳遞。

3? 討論

植物葉片細胞顯微結構變化能夠明顯且直觀的反映出植物對環境的適應情況[19]。常溫情況下2個品種在結構上有細微的差異：‘F200木薯幼苗蠟質厚度更厚，氣孔數量也多于‘華南8號，這一結構特點也反映出‘F200耐低溫的特征。低溫脅迫之后，‘F200氣孔迅速關閉，表面蠟質晶體出現熔融現象將氣孔包裹住，這一特征與倪郁等[20]對低溫下擬南芥表皮蠟質變化情況一致，而‘華南8號在應對低溫脅迫時反應速度遠小于‘F200，其受傷程度也更高。質體小球在非生物或生物脅迫過程有參與適應過程[21]。有研究表明，在遭受脅迫的情況下，大部分的質體小球來源于類囊體的溶解[22]。在本試驗中，隨著低溫脅迫時間的增加，‘華南8號葉綠體內質體小球數量劇增且遠大于‘F200葉綠體內質體小球數量，這表明‘F200植物特性可以緩解類囊體的解體，維持葉綠體的正常功能。并且隨著脅迫時間的增加，‘F200淀粉粒合成數量明顯增多，主要用于緩解細胞失水，反作用于細胞的低溫耐性。在脅迫24 h后，‘F200細胞結構仍較為完整，能觀察到正在合成淀粉顆粒的線粒體，而‘華南8號木薯葉肉細胞出現死亡現象。正常生長狀態下，2個品種木薯幼苗的葉綠素熒光參數沒有明顯差異，而在低溫脅迫下，2個品種木薯葉綠素熒光參數發生變化，其中，ABS/RC、TRo/RC和DIo/RC顯著增加且‘SC8增幅大于‘F200，ETo/TRo明顯減小且‘F200明顯小于‘SC8，這與彭晨等[23]的結果一致，說明‘F200在緩解低溫脅迫對光和器官和功能上強于‘華南8號。同時，低溫脅迫導致與電子傳遞能力有關的葉綠素熒光參數φo、φEo和φRo均下降，其中‘華南8號比‘F200下降幅度更大，有研究表明，其原因可能是低溫導致類囊體膜的流動性減小，從而導致類囊體膜上的反應中心、捕光天線、電子傳遞體等蛋白的結構或構象發生變化[24]，這與本研究中透射電鏡圖中‘華南8號類囊體的溶解情況基本一致。

綜上所述，本研究通過低溫下木薯葉片結構和葉綠素熒光參數的變化，從這2個角度闡釋了‘F200在低溫耐性的深層原理。‘F200木薯氣孔周圍具備更濃密的絨毛結構、各細胞器在應對低溫逆境有更強的抗壓能力、電子傳遞所耗能量份額較‘SC8小、熱耗散的能量份額較‘SC8大，具備耐低溫的潛力，對于打破種植區域溫度條件的限制有重大作用，具有很大的發展潛力。

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責任編輯：白? 凈