油棕EgGRF轉錄因子家族的全基因組鑒定與表達分析

金龍飛 尹欣幸 曹紅星

摘? 要：生長調控因子（Growth regulating factor，GRF）是植物中重要的轉錄因子，參與植物生長、發育和逆境脅迫響應等多種生物學過程。本研究從油棕（Elaeis guineensis）基因組中鑒定出15個EgGRF基因家族成員，并對其理化性質、染色體定位、基因結構、保守功能域、進化關系、啟動子順式作用元件、組織表達模式和果肉不同時期表達模式進行分析。結果表明：EgGRF基因家族成員編碼的肽鏈平均為409個氨基酸，分子量為27.62～65.51 kDa，等電點為6.24～9.38，蛋白不穩定指數為47.24～68.37，脂溶指數為47.52～67.69，總平均親水性為–0.945～–0.400。EgGRF基因家族成員含有3～5個外顯子，均含有特征結構域QLQ（Gln、Leu、Gln）和WRC（Trp、Arg、Cys），基于系統進化關系將EgGRF家族分為5個亞族，油棕EgGRF的親緣性與擬南芥較近。啟動子上鑒定出大量植物激素響應、逆境脅迫響應、光響應和分生組織特異表達順式作用元件。不同組織的轉錄組數據分析結果表明，EgGRF基因家族在莖尖和花中表達量較高，8個EgGRF在果肉的不同時期特異表達。本研究為進一步探索EgGRF調控油棕生長發育過程的機制奠定基礎。

關鍵詞：EgGRF;油棕;生物信息學;基因表達

中圖分類號：S565.9????? 文獻標識碼：A

Genome-wide Identification and Expression of EgGRF Gene Family in Oil Palm

JIN Longfei， YIN Xinxing， CAO Hongxing*

Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Laboratory of Tropical Oil Crops Biology， Wenchang， Hainan 571339， China

Abstract： Growth regulating factor （GRF） is an important transcriptional factor in plants which is involved in various biological processes， including regulating plant growth， development， and stress response. In this study， 15 EgGRF transcription factor family members were identified from the oil palm genome using bioinformatics methods， and the physicochemical properties， chromosomal location， gene structure， conserved functional domains， evolutionary relationships， promoter cis-acting elements， tissue expression patterns and mesocarp expression patterns at different stages were analyzed. The results showed that the EgGRF family members encoded an average of 409 aa in the peptide. The molecular weight was between 27.62 and 65.51 kDa， the isoelectric point was between 6.24 and 9.38， the instability index was between 47.24 and 68.37， the aliphatic index was between 47.52 and 67.69， and the gravy was between –0.945 and –0.400. Each EgGRF members contained 3-5 exons， and contained QLQ （Gln， Leu， Gln） and WRC （Trp， Arg， Cys） domain. EgGRF family was divided into 5 groups based on phylogenetic relationships， and was closely related to the Arabidopsis. Analysis of transcriptome data from different tissues showed that the EgGRF family was significantly high expressed in the shoot and flower. Eight EgGRFs were specifically expressed in different stages of mesocarp. The results would provide useful information and resource for the further investigation of EgGRF on oil palm growth and development.

Keywords： EgGRF; oil palm; bioinformatics; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.07.002

轉錄因子是一類重要的調控基因，參與植物生長、發育、代謝、繁殖、分化、逆境響應等多種生物學過程[1-3]。目前在植物中已經發現了60多個轉錄因子家族，其中生長調控因子（Growth regulating factor，GRF）主要在植物生長發育中起重要的調控作用[4-5]。GRF轉錄因子的N端有2個保守結構域，分別是QLQ（Gln、Leu、Gln）和WRC（Trp、Arg、Cys）保守結構域[6]。QLQ結構域可通過與GRF互作因子（GRF-interacting factor1，GIF1）結合，形成轉錄共激活因子，激活下游的靶基因表達;WRC結構域包含一個核定位信號NLS區域和一個與DNA結合的鋅指基序，均與GRF轉錄因子生物學功能密切相關[7]。植物中第一個編碼GRF轉錄因子的基因OsGRF1是在水稻中發現的，該基因通過調控赤霉素代謝誘導莖伸長[8]。OsGRF4通過調控2個細胞分裂素脫氫酶前體基因（OsCKX5和OsCKX1）的表達，增加細胞分裂素的含量，進而促進稻穗的伸長[9]。擬南芥AtGRF5通過調控細胞增殖，刺激葉綠體分裂，增加葉綠素含量，促進葉片生長[10]。AtGRF1、AtGRF4、AtGRF8、AtGRF9通過調控PTL基因控

制體胚發生過程中內源生長素的合成[11]。OsGRF4還能與miR396c、OsGIF1互作調控水稻籽粒大小[12]，對提高水稻產量具有重要意義。在油菜中的研究也發現，超表達BnGRF2能夠調控細胞分裂、葉綠素含量和光合作用效率，進而增加油菜的產油量[13]。隨著越來越多植物基因組測序完成，GRF基因家族在擬南芥[14]、水稻[15]、番茄[16]、藜麥[17]、大豆[18]、茶樹[19]、棉花[20]、龍眼[21]等多個物種中被鑒定出來，而在油棕中的研究未見報道。

油棕（Elaeis guineensis）是世界上產油效率最高的油料作物，油量高達4.27 t/hm2，是花生的7～8倍、大豆的9～10倍[22]。油棕果壓榨的棕櫚油，廣泛應用于食品加工、日用化工、機械潤滑和生物柴油等領域[23]。近年來市場對棕櫚油的需求逐年增加，油棕種植業的快速發展毀壞了大量的熱帶雨林。因此，提高油棕單產是維持熱帶雨林保護和食用油短缺平衡的重要途徑，而挖掘控制油棕重要農藝性狀的關鍵基因并采用分子育種加快高產油棕品種的選育是油棕育種研究的重要工

作[24]。本研究基于油棕基因組數據庫挖掘和鑒定調控油棕生長的轉錄因子EgGRF，分析其理化性質、染色體定位、基因結構、保守結構域、進化關系、啟動子順式作用元件，同時分析其在不同組織和果肉不同發育時期的表達模式，為進一步探索EgGRF調控油棕生長發育過程的機制奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 油棕EgGRF基因家族的挖掘與鑒定

油棕全基因組數據從NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ ID：2669）中下載，擬南芥AtGRF蛋白質序列從TAIR數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）中下載，水稻OsGRF蛋白序列從NCBI數據庫中下載。以AtGRF和OsGRF蛋白質序列作為參考序列，通過Blsatp在油棕基因組數據庫中進行比對。將獲得的蛋白序列提交到NCBI的保守結構域數據庫，利用Batch Web CD-search Tool軟件[25]進行保守結構域分析。利用在線工具ExPAsy（http：//www.expasy.org）分析油棕EgGRF基因家族的蛋白質分子量、等電點、蛋白不穩定指數、脂溶指數和總平均親水性等理化性質。

1.2? 油棕EgGRF基因家族的基因結構、保守結構域、染色體定位及進化分析

油棕EgGRF基因家族的基因結構、保守結構域和染色體定位均采用Tbtool軟件[26]進行可視化分析。采用ClustalW軟件[27]對油棕、擬南芥和水稻的GRF蛋白質序列進行多重比對，采用MEGA 6.0軟件的Neighbor-joining法進行建樹，分析進化關系，設置校驗值Bootstrap為1000。

1.3? 油棕EgGRF基因家族的啟動子順式作用元件分析

從NCBI數據庫中下載油棕EgGRF基因CDS上游2000 bp的序列。利用Plant Care軟件[28]進行順式作用元件分析，采用Tbtool軟件進行可視化分析[26]。

1. 4? 油棕EgGRF基因家族的表達分析

油棕的根（SRR851071）、莖尖（SRR851103）、葉（SRR851096）、花（SRR851108）和花后15周（SRR190698）、17周（SRR190699）、21周（SRR190701）和23周（SRR190702）果肉的轉錄組數據從NCBI的SRA數據庫（https：//trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi？）中下載。利用RPKM值對轉錄組數據進行歸一化處理，利用基迪奧云平臺在線工具（https：//www.omicshare.com/tools/）繪制熱圖。

2? 結果與分析

2.1? 油棕EgGRF基因家族的全基因組鑒定和理化性質分析

通過Blastp比對分析獲得油棕EgGRF的候選蛋白質序列，預測保守結構域，去除不含QLQ和WRC保守結構域的序列，共獲得15個EgGRF家族成員。根據其與擬南芥的同源性順序進行命名，依次命名為EgGRF1～EgGRF15。油棕EgGRF多肽鏈氨基酸數目為260～611，平均為409;蛋白質分子量為27.62～65.51 kDa，平均為44.71 kDa;等電點為6.24～9.38，平均為7.86;蛋白不穩定指數為47.24～68.37，平均為59.48，表明EgGRF家族成員編碼的均為不穩定蛋白;脂溶系數為47.52～67.69，平均為59.23，脂溶性一般;總平均親水性為–0.945～–0.400，平均為–0.633，都為負值，表明EgGRF均為親水性蛋白（表1）。

2.2? 油棕EgGRF基因家族成員在染色體上的定位

對油棕EgGRF基因家族在染色體上位置進行分析（圖1），發現15個EgGRF基因家族成員分布 在7條染色體和5個Scaffolds上。EgGRF10在Chr3上，EgGRF2、EgGRF7在Chr4上，EgGRF5在Chr10上，EgGRF4在Chr11上，EgGRF9、EgGRF11在Chr13上，EgGRF6、EgGRF12在Chr15上，EgGRF14在Chr16，EgGRF1、EgGRF3、EgGRF8、EgGRF13、EgGRF15分別在5個Scaffolds上。EgGRF4和EgGRF7，EgGRF6和EgGRF9存在基因共線性現象。

2.3? 油棕EgGRF的基因結構、保守結構域和進化關系

15個油棕EgGRF基因家族具有3～5個外顯子，其中EgGRF4、EgGRF7有3個外顯子，EgGRF8、EgGRF13有5個外顯子，其余EgGRF成員均為4個外顯子（圖2）。15個EgGRF基因家族成員均含有GRF轉錄因子特有的WRC和QLQ保守結構域（圖3）。為了分析油棕EgGRF基因家族的進化發育關系，將油棕EgGRF和AtGRF、OsGRF蛋白質序列進行多重比對構建進化樹。根據進化樹分支（圖4），可將15個EgGRF分成5個亞族，EgGRF5、EgGRF10、EgGRF11、EgGRF12、EgGRF13、EgGRF14、EgGRF15為Ⅰ亞族，EgGRF4、EgGRF7為Ⅱ亞族，EgGRF3為Ⅲ亞族，EgGRF2、EgGRF8為Ⅳ亞族，EgGRF1、EgGRF6、EgGRF9為V亞族。其中第Ⅲ和第Ⅳ亞族EgGRF僅與AtGRF聚在一起，表明油棕的EgGRF與擬南芥的親緣關系更近。

2.4? 油棕EgGRF基因家族的啟動子順式作用元件的鑒定

在油棕EgGRF基因家族的啟動子中鑒定了大量的順式作用元件（EgGRF8的啟動子中有大量的堿基未測序，故順式作用元件較少）（圖5），包括生長素響應（10個）、脫落酸響應（21個）、赤霉素響應（19個）、茉莉酸甲酯響應（21個）、水楊酸響應（10個）、低溫響應（3個）、干旱響應（7個）、光響應（53個）、防衛和逆境響應（4個）、分生組織特異表達（12個）等順式作用元件，表明EgGRF參與植物激素和環境刺激的應答。

2.5? 油棕EgGRF基因家族的表達分析

油棕EgGRF基因家族在不同組織中表達量差異較大（圖6），其中EgGRF1、EgGRF2、EgGRF3、EgGRF5、EgGRF6、EgGRF7、EgGRF9、EgGRF10、EgGRF12、EgGRF13、EgGRF14在莖尖中高表達，EgGRF4、EgGRF11、EgGRF15在花中高表達;EgGRF基因家族在根和葉中的表達量均較低，僅EgGRF8在葉片中表達量較高，這表明GRF在油棕的莖尖和花發育過程中起重要調控作用。8個EgGRF基因在果肉發育的不同時期中特異表達不同（圖7），其中EgGRF2、EgGRF9、EgGRF14在花后15周的果肉中高表達，EgGRF6、EgGRF8在花后17周的果肉中高表達，EgGRF3在花后21周的果肉中高表達，EgGRF11、EgGRF15在花后23周的果肉中高表達，這表明不同的EgGRF分別在油棕發育的不同時期起調控作用。

3? 討論

隨著基因組測序技術的發展和生物信息學研

究的不斷深入，大量植物完成了全基因組測序，這為植物基因家族的挖掘、鑒定和功能分析提供了有利條件。GRF轉錄因子是植物中特有的一類轉錄因子，在葉片生長、子葉生長、莖伸長、花發育、籽粒發育、胚胎發生等生長發育過程中起重要的調控作用[5， 8， 11， 14]。油棕作為世界上產油效率最高的油料作物，其GRF基因家族的研究尚未見報道，而在擬南芥和水稻等模式植物中研究較為深入，這些研究給油棕EgGRF的研究提供參考。

本研究利用生物信息學分析，從油棕基因組中鑒定了15個EgGRF基因家族成員，比擬南芥（9個）和水稻（12個）成員數目更多，EgGRF4和EgGRF7、EgGRF6和EgGRF9存在基因共線性，這可能是油棕在進化過程中發生了基因串聯復制而導致EgGRF基因數目增加。基因復制事件能夠導致植物基因組中形成大量的重復基因，重復基因的存在能夠促進基因新功能的進化，增強植物對環境變化的適應性[29]。油棕EgGRF轉錄因子的蛋白長度、分子量、等電點、蛋白不穩定指數、脂溶指數和總平均親水性等基本特性存在較大差異，與擬南芥和水稻中的研究相似。基因的結構分析發現，絕大部分EgGRF基因具有4個外顯子，與擬南芥AtGRF家族的基因結構分布相似，其中EgGRF8的第4個和第5個外顯子之間有個極短的內含子，植物進化過程中轉座子的插入可能導致內含子數目的增加[30]，EgGRF8內含子的產生可能是轉座子插入導致的。進化分析發現油棕EgGRF優先與AtGRF聚在一起，表明油棕EgGRF與擬南芥的親緣關系更近。

EgGRF主要在油棕的莖尖、花和果肉中表達，可能是由于EgGRF在這些組織或器官的生長發育中發揮著重要調控作用。研究發現GRF在幼嫩組織中的表達較高，在成熟的組織和器官中表達量低[31-33]。在本研究中EgGRF1、EgGRF2、EgGRF3、EgGRF5、EgGRF6、EgGRF7、EgGRF9、EgGRF10、EgGRF12、EgGRF13、EgGRF14在莖尖中的表達顯著高于其他組織。莖尖是油棕的頂端生長點，分生能力極強，EgGRF的高表達可能與油棕莖尖旺盛的分生能力相關，同時EgGRF啟動子中也鑒定了大量分生組織特異表達響應元件。在楊樹中的研究發現PtGRF在莖尖生長中起著重要的調控作用[34]，在玉米中的研究發現ZmGRF與ZmGIF1基因互作調控莖尖的發育[35]。GRF還參與植物根的發育[36]，而本研究發現在生長極為旺盛的根尖部分EgGRF整體表達都很低，這表明油棕根發育可能主要受其他轉錄因子的調控，例如NAC1、TIR1等。EgGRF4、EgGRF11、EgGRF15在花中的表達量顯著高于其他組織，表明EgGRF在油棕花發育中起重要的調控作用，在擬南芥和毛果楊中的研究也發現GRF對花的發育起重要的調控作用[37-38]。GRF在果實發育中起重要調控作用，在柑橘中的研究發現CsGRF3和CsGRF4在果實發育前期高表達，且受赤霉素的誘導[39]。花后15周，油棕完成細胞分裂和膨脹，進入成熟階段;花后17周，油棕果皮開始轉色;花后21周，油棕進入內含物的快速積累期，乙烯含量達到峰值;花后23周，油棕進入完熟期，內含物積累達到峰值[40]。為探索EgGRF在油棕果肉發育中的作用，選擇4個時期進行基因表達分析，結果發現EgGRF2、EgGRF6、EgGRF8、EgGRF9、EgGRF14在油棕果肉發育前期高表達，EgGRF3、EgGRF5、EgGRF11在油棕果肉發育后期高表達，這表明不同EgGRF在油棕果肉發育的不同時期都起調控作用，同時在EgGRF啟動子上也發現大量與果實發育密切相關的植物激素應答元件，如生長素、赤霉素和脫落酸應答元件。油棕果肉發育的不同階段受不同激素的調控，前期主要受生長素、赤霉素和細胞分裂素的調控，后期主要受乙烯和脫落酸的調控[40]，而EgGRF的表達受赤霉素、脫落酸和水楊酸等植物激素的誘導[16]，這表明EgGRF在激素控制果肉發育中起著重要的調控作用。果肉是油棕主要的產油器官，因此明確EgGRF在果肉發育中的調控機制對提高油棕的產油量具有重要的意義。在后續的研究中還需要利用轉基因技術或基因編輯技術對這些基因的功能和作用機制進一步驗證。

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責任編輯：黃東杰