Relaxin-3通過抑制HMGB1介導的NLRP3炎性小體活化抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞轉分化

翁方中，胡朝梁，嚴駿，戴偉，周瑞祥

(武漢市第一醫院重癥醫學科，湖北 武漢 430022)

目前，高血壓和心肌梗死等心血管疾病發病率較高，是全球主要的死亡原因。延緩心肌纖維化的發展是降低心血管疾病死亡風險的優化策略[1]。心肌成纖維細胞是過量細胞外基質的主要穩態調節器。由于缺氧等病理刺激，心肌成纖維細胞被激活，轉化為肌成纖維細胞，后者在心肌纖維化中起著重要作用。肌成纖維細胞分泌過量的細胞外基質，如膠原和基質金屬蛋白酶，從而導致心肌僵硬異常、心臟纖維化和心力衰竭[2]。NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3 ，NLRP3)炎性小體由NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteinase-1，caspase-1)和凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)組成。NLRP3炎癥小體在一些心臟疾病中被激活，如心肌梗死、主動脈瓣疾病、心肌炎、缺血/再灌注損傷、高血壓和動脈粥樣硬化，參與心臟疾病進展[3]。高遷移率族蛋白B1(high-mobility group box 1 ，HMGB1)是一種廣泛存在的核蛋白，可通過誘導NLRP3炎癥小體的激活，引起急性損傷和炎癥[4]。人松弛素3(relaxin-3)是一種具有類似胰島素結構的生物活性肽，主要在大腦中表達，可調節覺醒、進食、學習、記憶和中樞對生理應激源的反應[5]。外源性relaxin-3通過抑制NLRP3炎癥小體活化，能有效減輕糖尿病大鼠心肌細胞凋亡和心肌纖維化，從而改善糖尿病大鼠心肌損傷[6]。但是，關于relaxin-3對心肌纖維化的作用機制尚未明確。因此，本研究應用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)處理心肌成纖維細胞，建立體外心肌纖維化模型，旨在探究relaxin-3是否通過HMGB1調控AngⅡ處理的心肌成纖維細胞中NLRP3炎癥小體的激活，以期為明確relaxin-3對心肌纖維化的作用機制及開發新的抗纖維化治療策略提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大鼠心肌成纖維細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；重組relaxin-3購自美國Phoenix Pharmaceuticals； AngⅡ購自美國Sigma公司；過表達載體陰性對照(oe-NC)和HMGB1過表達載體(oe-HMGB1)購自武漢金開瑞生物工程有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；細胞計數檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自美國MedChemExpress；5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔單克隆抗體抗α平滑肌肌動蛋白(anti-α smooth muscle actin，α-SMA)、兔單克隆抗體波形蛋白(vimentin)、兔單克隆抗體凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speck like protein，ASC)、兔單克隆抗體裂解的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cleaved caspase-1)購自英國Abcam公司； 鼠單克隆抗體I型膠原(collagen Ⅰ)、兔多克隆抗體III型膠原(collagen Ⅲ)、兔多克隆NLRP3抗體和鼠單克隆GAPDH抗體購自美國GeneTex公司；兔多克隆HMGB1抗體購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 細胞培養

大鼠心肌成纖維細胞用含有10% 胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的杜爾貝科的改良鷹培養基(dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養基培養，其中DMEM培養基中含有100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。細胞置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養，待細胞融合度達到了80%～90%，胰酶液消化細胞，DMEM培養基重懸細胞，繼續傳代培養或進行鋪板操作。

1.3 細胞給藥處理

將對數期生長的大鼠心肌成纖維細胞接種于6孔板中，每孔細胞數量為1×106個。細胞繼續培養24 h后，將細胞隨機分為空白對照組、AngⅡ組和relaxin-3組，AngⅡ組細胞添加2 μmol/L Ang II[7]，relaxin-3組細胞添加2 μmol/L Ang II和100 ng/mL relaxin-3[8]，空白對照組添加等量磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)。細胞繼續培養24 h后，進行后續實驗操作。

1.4 細胞轉染

將對數期生長的大鼠心肌成纖維細胞接種于6孔板中，每孔細胞數量為1×106個。細胞繼續培養24 h后，將細胞隨機分為AngⅡ組、relaxin-3組、relaxin-3+oe-NC組(轉染oe-NC)和relaxin-3+oe-HMGB1組(轉染oe-HMGB1)，將細胞培養基更換為新鮮培養基，按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行細胞轉染。細胞繼續培養48 h后，向各組細胞中添加2 μmol/L Ang II，向relaxin-3組、relaxin-3+oe-NC組和relaxin-3+oe-HMGB1組添加100 ng/mL relaxin-3。細胞繼續培養24 h后，進行后續實驗操作。

1.5 CCK-8檢測細胞活力

胰酶液消化對數期生長的大鼠心肌成纖維細胞，新鮮DMEM培養基重懸細胞，取細胞懸液接種于96孔板，每孔5×103個細胞，細胞繼續培養24 h后，向細胞中添加CCK-8溶液(10 μL/孔)，將細胞置于37 ℃下靜置孵育4 h后，用酶標儀測定每孔在450 nm處的光密度(optical density，OD)值。Ang II組細胞活力(%)=OD實驗組/OD空白對照組×100%，Relaxin-3組細胞活力(%)=OD實驗組/ODAngⅡ組×100%。

1.6 EdU檢測試劑盒檢測細胞增殖

向給藥處理或者是細胞轉染后的大鼠心肌成纖維細胞中添加EdU工作液，使其終濃度為10 μmol/L，細胞置于37 ℃下靜置孵育2 h。棄去細胞上清液，4%多聚甲醛室溫固定細胞15 min。棄去固定液，PBS洗滌細胞后，添加0.3% Triton X-100處理細胞15 min。去除通透液，PBS洗滌細胞后，添加Click-iTTM細胞反應緩沖液室溫避光孵育30 min，隨后添加4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)室溫條件下孵育10 min。PBS洗滌細胞后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。EdU陽性細胞數(%)=EdU陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.7 Western blot檢測細胞中α-SMA、vimentin、collagenⅠ、collagen Ⅲ、NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和HMGB1蛋白表達

收集給藥處理或細胞轉染后的大鼠心肌成纖維細胞，蛋白裂解液裂解細胞后，收集細胞上清液，BCA法測定上清液蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和轉膜操作。添加5% 牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)封閉液室溫條件下孵育3 h。向細胞中添加α-SMA(1∶1 000)、vimentin(1∶2 000)、collagenⅠ(1∶1 000)、collagen Ⅲ(1∶1 000)、NLRP3(1∶2 000)、ASC(1∶2 000)、cleaved caspase-1(1∶1 000)、HMGB1(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)抗體稀釋液，4 ℃下靜置孵育過夜。添加特異性二抗(1∶5 000) 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記親和純化山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)，室溫條件下孵育1 h。滴加電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)溶液，凝膠成像系統檢測蛋白條帶，Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.8 間接免疫熒光檢測細胞中NLRP3的表達

棄去給藥處理或細胞轉染后的大鼠心肌成纖維細胞的培養基，PBS清洗細胞后，添加4%多聚甲醛室溫條件下固定細胞15 min。PBS清洗細胞，添加0.3% Triton X-100處理細胞15 min。PBS清洗細胞后，添加5% BSA封閉液室溫條件下封閉30 min。棄去封閉液，添加NLRP3抗體稀釋液(1∶200)，4 ℃下靜置孵育過夜。添加特異性熒光二抗(1∶5 000) Alexa Fluor?偶聯二抗，室溫條件下避光孵育1 h。滴加DAPI室溫條件下孵育10 min。PBS清洗細胞后，熒光顯微鏡下觀察并拍照。Image J軟件分析各組細胞熒光強度。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 relaxin-3對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖的影響

與空白對照組相比，AngⅡ組細胞活力明顯升高(P<0.05)，EdU陽性細胞數明顯升高(P<0.05)；與AngⅡ組相比，Relaxin-3組細胞活力明顯降低(P<0.05)，EdU陽性細胞數明顯降低(P<0.05)。見圖1。

2.2 relaxin-3對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞轉分化和膠原產生的影響

與空白對照組相比，AngⅡ組細胞中α-SMA、vimentin、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05)；與AngⅡ組相比，relaxin-3組細胞中α-SMA、vimentin、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達水平卻明顯下降(P<0.05)。見圖2。

2.3 relaxin-3對AngⅡ誘導的心肌細胞NLRP3炎性小體和HMGB1表達的影響

與空白對照組相比，AngⅡ組細胞中NLRP3熒光強度和NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、HMGB1蛋白表達均明顯增多(P<0.05)；與AngⅡ組相比，relaxin-3組細胞中NLRP3熒光強度和NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、HMGB1蛋白表達均明顯降低(P<0.05)。見圖3。

2.4 過表達HMGB1對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞NLRP3炎性小體的影響

與AngⅡ組相比，relaxin-3組細胞中NLRP3熒光強度和NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、HMGB1蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；relaxin-3組和relaxin-3+oe-NC組兩組間NLRP3熒光強度和NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、HMGB1蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與relaxin-3+oe-NC組相比，relaxin-3+oe-HMGB1組細胞中NLRP3熒光強度和NLRP3、ASC、cleaved caspase-1、HMGB1蛋白表達均明顯升高(P<0.05)。見圖4。

2.5 過表達HMGB1逆轉relaxin-3對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖的影響

與AngⅡ組相比，relaxin-3組細胞活力明顯降低(P<0.05)，EdU陽性細胞數明顯降低(P<0.05)；relaxin-3組和relaxin-3+oe-NC組兩組間細胞活力和EdU陽性細胞數比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與relaxin-3+oe-NC組相比，relaxin-3+oe-HMGB1組細胞活力明顯升高(P<0.05)，EdU陽性細胞數明顯升高(P<0.05)。見圖5。

2.6 過表達HMGB1逆轉relaxin-3對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞轉分化和膠原產生的影響

與AngⅡ組相比，relaxin-3組細胞中α-SMA、vimentin、collagenⅠ和collagen Ⅲ蛋白表達明顯降低(P<0.05)；relaxin-3組和relaxin-3+oe-NC組兩組間α-SMA、vimentin、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)；與relaxin-3+oe-NC組相比，relaxin-3+oe-HMGB1組細胞中α-SMA、vimentin、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖6。

3 討論

纖維化疾病的死亡率極高，每年可導致全球超過80萬人死亡，其中大部分是肺和心臟纖維化[9]。損傷后生理性細胞外基質重塑是組織再生的一個自然且至關重要的過程。相反，病理性重塑，包括纖維性膠原的產生，會導致非功能性瘢痕和組織功能受損。雖然心臟纖維化的種類已有較明確的分型，但導致纖維化發生和心臟瘢痕形成過程的致病機制仍未完全清楚[10]。在心臟疾病中，特別是心臟纖維化領域，迫切需要探究纖維化相關致病機制并開發新的、有效的治療方法。

心肌成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化與I型和III型膠原的產生有關，其中I型膠原含量最為豐富[11]。雖然組織修復過程是對組織損傷的一種重要的短期適應，但持續、長期產生的細胞外基質蛋白會導致心肌僵硬和順應性差，從而導致心功能障礙[12]。因此，靶向抑制心肌成纖維細胞轉分化在心肌纖維化過程中起重要作用[13]。松弛素家族多肽受體廣泛分布于心、腦、腎和生殖系統，relaxin與其受體結合后可觸發抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗纖維化途徑[14]。relaxin-2是松弛素家族成員之一，可通過抑制纖維化、瘢痕形成和炎癥水平來控制子宮內膜異位癥病變[15]。本研究應用AngⅡ處理心肌成纖維細胞，建立體外心肌纖維化模型，隨后用relaxin-3處理細胞，結果顯示，AngⅡ處理可誘導心肌成纖維細胞增殖，還可上調肌成纖維細胞標志物α-SMA和vimentin的表達，以及提高collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的表達水平，而relaxin-3處理可明顯逆轉AngⅡ對心肌成纖維細胞的作用，抑制心肌成纖維細胞增殖，下調肌成纖維細胞標志物α-SMA和vimentin的表達，且降低collagenⅠ和collagen Ⅲ的表達水平。因此，relaxin-3可在AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞中發揮抗纖維化作用。

NLRP3炎癥小體的激活可促進膠原蛋白的產生和細胞因子白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的分泌，導致肺、肝和腎等器官的纖維化發展[16]。AngⅡ可促進NLRP3炎癥小體介導的膠原合成，導致caspase-1活化和IL-1β分泌，最終導致小鼠心肌纖維化。然而，NLRP3基因缺失可減輕線粒體異常、心臟炎癥、氧化應激和纖維化，從而減輕心臟功能紊亂和肥大[17]。人皮膚成纖維細胞中NLRP3炎癥小體激活可誘導細胞向肌成纖維細胞分化(α-SMA表達上調和膠原沉積)，relaxin-2可通過靶向抑制NLRP3炎癥小體激活逆轉上述變化[18]。另外，Zhang等[19]指出，高糖通過激活NLRP3炎癥小體誘導新生大鼠心肌成纖維細胞膠原合成，導致caspase-1激活、IL-1β和白介素-18(interleukin-18，IL-18)分泌。本研究顯示，AngⅡ處理可誘導心肌成纖維細胞中NLRP3、ASC和cleaved caspase-1蛋白表達，而relaxin-3處理可明顯逆轉AngⅡ處理的心肌成纖維細胞中NLRP3、ASC和cleaved caspase-1蛋白表達，與Zhang等[19]的研究結果基本一致，表明relaxin-3可抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞中NLRP3炎性小體激活。

目前，關于relaxin-3抑制NLRP3炎性小體激活的相關機制尚未明確。抑制HMGB1可能是治療組織纖維化的一種治療方法[20]。Zhang等[21]的研究結果表明，HMGB1與壓力超負荷小鼠較高的死亡率、膠原含量及較低的左室射血分數相關，外源性HMGB1在心肌中的過度表達可促進心肌纖維化、加重了壓力超負荷引起的左室功能障礙。敲低HMGB1還可通過抑制NLRP3炎性小體激活在胃潰瘍小鼠中發揮抗炎和抗潰瘍作用[22]。此外，靶向抑制HMGB1依賴的NLRP3炎性小體失活可明顯減輕脂多糖誘導的乳鼠心肌細胞炎癥和凋亡，減輕細胞損傷[23]。本研究顯示，AngⅡ處理可誘導心肌成纖維細胞中HMGB1蛋白表達，而relaxin-3處理可明顯抑制AngⅡ處理的心肌成纖維細胞中HMGB1蛋白表達，進而使relaxin-3和AngⅡ處理的心肌成纖維細胞中NLRP3、ASC和cleaved caspase-1蛋白表達上調，且細胞增殖能力、α-SMA、vimentin、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的表達也均上調。因此，relaxin-3可通過抑制HMGB1/NLRP3炎性小體軸在AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞中發揮抗纖維化作用。

綜上所述，relaxin-3可通過抑制HMGB1介導的NLRP3炎性小體活化，抑制AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖以及α-SMA、vimentin、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的表達，從而發揮抗纖維化作用。