HBV-DNA實時熒光定量PCR檢測試劑性能評價

劉紅敏

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒(HBV)，是目前已知的感染人的最小DNA病毒之一，直徑只有頭發絲的1/40 000，而它也是最難治愈的病毒之一[1,2]。HHBV雖然是一個雙鏈DNA病毒，但和身為RNA的艾滋病毒(HIV)一樣，其復制存在著逆轉錄的過程，使得病毒基因組可以被整合到機體中，使得機體難以將病毒徹底清除，成為潛在致癌的隱患；另外HBV在進入肝細胞后可以轉化成cccDNA，并長期潛伏在細胞核中，具有很強的隱蔽性，即使抗病毒治療也難以徹底清除；而一旦患者長期使用免疫抑制劑或化療、放療導致機免疫力低下，cccDNA則會跳出轉入活躍的復制狀態，使得HBV感染長期持續性存在。因此，HBV在目前醫療水平上，是一個可以控制但不能徹底清除的病毒[3]。HBV-DNA的檢測和監測在預防和乙型肝炎患者的治療過程中非常重要。參照美國臨床實驗室標準化委員會頒布的EP系列文[4,5]件及《醫學實驗室質量和能力認可準則在基因擴增檢驗領域的應用說明》[6]和《核酸檢測試劑盒質量評價技術規范》[7]，從精密度、正確度、檢測限(定量檢測下限)、線性范圍分析性能標準操作來評價和評估我們實驗室檢測乙型肝炎病毒的檢測系統[8]。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與檢測試劑 擴增儀為美國ABI StepOnePlus；加樣器為賽默飛醫療器械有限公司提供；高速冷凍離心機來自湖南湘儀實驗室儀器開發公司；檢測試劑盒為艾康生物有限公司提供。

1.2 實驗樣本選擇 精密度實驗所用定值陽性樣本為故城縣醫院核酸實驗室收集的高濃度的陽性標本的混合物，正確度所用參考物質為2020年衛生部臨檢中心核酸病毒學室間質評標本。稀釋用血清為陰性血清(HBV-DNA,HIV,HCV,TP等感染性疾病篩查均為陰性)，且該陰性血清無脂血溶血等異常情況。

1.3 檢測原理 試劑盒選用乙型肝炎病毒保守基因片段設計特異引物及特異Taqman探針，該探針能與引物擴增區域中間的一段DNA模板發生特異性結合，PCR延伸反應中，Taq酶的外切酶活性將5’端熒光基團從探針上切割下來，使之游離于反應體系中，從而脫離了3’端熒光淬滅基團的屏蔽，即能接受光刺激而發出可供儀器檢測的熒光，從而實現在全封閉反應體系中對乙型肝炎病毒核酸的全自動化檢測。試劑盒中使用內質控體系，能夠有效防止假陰性，同時也使用UNG+dUTP防污染措施，能夠有效排除假陽性結果。

1.4 檢測方法 取待測樣本(血清)，陰陽性質控品，定量標準品各200 μl，分別加入200 μl核酸提取液1’振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min；棄上清350 μl，留50 μl；加入50 μl核酸提取液2(內含固體沉淀顆粒物，為使顆粒均勻分布，每次取樣時請用吸頭反復吸打)；加入4 μl乙型肝炎病毒內標模板，振蕩混勻，100℃水浴或干浴10 min，然后12 000 r/min離心10 min，取上清20 μl加入到20 μl反應混合液(HBV反應混合液19.5 μl+0.5 μl Taq酶)中，蓋緊反應管蓋，轉移至PCR擴增檢測區。將各反應管按一定順序放入PCR擴增儀上，按擴增程序：25℃ 10 min，95℃ 3 min，(94℃ 15 s，58℃ 30 s)45個循環進行擴增。判斷標準：陰性質控CT值無數據；標準曲線相關系數應達到0.980以上；閾值線以上的熒光曲線應當是具有明顯S型曲線，否則實驗視為無效，應當檢查儀器，試劑，擴增條件等方面的誤差。

1.5 評估方法 依照《核酸檢測試劑盒質量評價技術規范》等相關文件及相關操作規范中的方法作精密度，正確度，檢測限，線性范圍等的評估檢測。

1.5.1 精密度評估:常用相對偏差(RSD=S/X×100%)表示精密度。批內精密度：將準備好的高濃度和低濃度的陽性定值樣本在同批試劑中分別進行20次重復測定(正向和逆向分別10次)，分別統計2種濃度樣本檢測值(濃度對數值)的均值和標準差，再計算批內相對偏差。批間精密度：將高濃度和低濃度的陽性定值樣本分別進行4次重復測定，連續檢測5 d，可得到40個數據，統計樣本檢測值(濃度對數值)的均值和標準差，再計算批間相對偏差。判斷標準為RSD<5%。

1.5.2 準確度評估:準確度是指在一定的條件下多次測定的平均值與真值相符合的程度，用來衡量系統誤差的指標。選用衛生部臨檢中2020第一次核酸檢測(病毒學)室間質評樣本作為參考品進行測定，檢測結果值與給的靶值和上下限進行對比，HBV-DNA檢測結果與靶值的偏差<±0.4對數值。即評價結果成績≥80%，正確度的驗證判定為通過。

1.5.3 檢測限評估:檢測限是指樣品中分析物的最小量，可以在規定的可能性條件下予以檢出[9]。將陽性定值樣本稀釋至200 U/ml(對數值為2.3)。重復檢測20次看是否符合《核酸檢測試劑盒質量評價技術規范》中檢出限的要求(重復測定20次，按95%的置信限下限，測定為陽性的次數應≥17次)。

1.5.4 線性范圍評估:線性范圍(臨床可報告范圍)是指陽性定值樣本經過稀釋或其他預處理的方式而間接獲得的分析物值的范圍。將高濃度陽性定值樣本進行系列梯度稀釋至200 U/ml，對高濃度樣本和稀釋后的樣本進行同批次檢測，每個樣本重復檢測3次，計算相關系數R2，如果R2>0.98，則線性范圍評估通過。

1.5.5 實驗過程需要注意事項:實驗過程中嚴格按照廠商標準操作進行檢測系統的校準，每次實驗均應按照室內質量控制程序進行室內質控，室內質控在控時，所做的實驗數據才可以采用，如出現失控數據，則要及時找出原因并予以糾正，重新進行檢測[10,11]。實驗樣本要穩定，其基質組成應盡可能與臨床樣本相似。實驗樣品的濃度盡可能選擇與廠商申明性能相近的濃度或接近該項目醫學決定水平的濃度[12]。通常選擇穩定好的血清基質的質控物作為試驗品[13]。注意冰凍保存實驗樣品內分析物的溫度性[14]。嚴格控制凍融的時間、混勻的操作手法。在正式實驗前，操作人員應熟練掌握儀器的操作程序、校準程序、保養程序以及檢測程序等，熟悉評價方案。為獲得準確的測量結果，由同一操作員按相同的方法、使用相同的檢測設施、嚴格按照操作規程進行操作[15]。

1.6 統計學分析 進行數據分析時應將濃度值轉化成對數值進行計算，應用SPSS 15.0統計軟件。進行線性范圍驗證時，應將實測值和理論值進行線性回歸分析。

2 結果

2.1 精密度的評價結果 批內相對偏差分別為1.27%和1.32%；批間相對偏差分別為1.6%和2.5%，均<5%。見表1。

表1 精密度評價

2.2 準確度評估 參照2020年度國家衛生健康委臨床檢驗中心和河北省臨床檢驗中心核酸檢測(病毒學)室間質評結果。見表2、3。

表2 2020年全國臨床實驗室核酸檢測(病毒)室間質評結果

2.3 檢測下限驗評估結果 將收集的高濃度臨床陽性標本稀釋至200 U/ml，分別用同批次試劑重復檢測20次，實驗全部檢測出有效數據，檢測結果符合GB/T 37871-2019《核酸檢測試劑盒質量評價技術規范》中檢出限的要求，并且重復檢測結果間的系數CV<20%。見表4。

表3 2020年河北省室間質評統計結果-臨床核酸檢測(病毒學)

表4 檢測下限結果

2.4 線性范圍評估 將收集到的臨床高濃度樣本梯度稀釋至2.00E+02 U/ml，以檢測樣本的濃度對數值作為橫坐標，檢測樣本的CT值作為縱坐標，得出樣本濃度對數值與CT值的相關系數R2為0.995；檢測樣本濃度對數值的實測值作為橫坐標，預期濃度對數值作為縱坐標，得出濃度對數值的實測值與預期濃度對數值的相關系數R2為0.999。樣本實測值結果與預測值結果比較差異沒有統計學意義。在2.00E+02-1.00E+07分析測量范圍線性關系良好(線性關系系數R2=0.99)。檢測結果符合GB/T 37871-2019《核酸檢測試劑盒質量評價技術規范》中線性范圍的要求：相關系數R2≥0.98。見圖1、2。

圖1 實測值與CT值散點

3 討論

乙型肝炎病毒具有頑強的抵抗力：對熱、低溫、干燥、紫外線、一般濃度的化學消毒劑都能夠耐受，但是HBV怕高熱，如加熱到100℃，只要10 min就可使其失去傳染性。乙型肝炎病毒有明顯的嗜肝性：它侵入人體后就要專門進攻肝臟，鉆入肝細胞，在那兒定居并繁衍后代。大量乙型肝炎病毒集中在肝細胞內，不斷地繁殖、復制，成熟的乙型肝炎病毒被釋放出肝細胞，又侵入別的健康的肝細胞，這樣不斷復制，不斷侵蝕，最后誘發肝細胞的免疫損傷[18]。乙型肝炎病毒攜帶者的感染幾乎都是在胎兒期或幼兒期感染乙型肝炎病毒的，經過了十幾年乃至幾十年的感染歷程，乙型肝炎病毒仍然在他們體內不消失，但也不發病。乙型肝炎病毒變異的特性給臨床診斷和治療帶來許多麻煩。癌變的原因可能是乙型肝炎病毒的X基因整合到肝細胞上，發生了突變，導致肝癌。早發現，早阻斷是預防感染乙型肝炎病毒的重要途徑，所以真實可靠的HBV-DNA檢測結果不僅是預防感染乙型肝炎病毒的關鍵也是監測乙型肝炎患者治療效果的關鍵指標。檢測系統的性能驗證是檢驗工作中保證檢測質量的前提。每個檢測項目都應該有它自己的性能驗證方案。根據CANS-CL02-A009:2018《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》要求，性能驗證內容至少包含精密度，正確度，檢測限，線性范圍等內容[19]。

圖2 實測值與預期值散點圖

我們實驗室依據GB/T 37871-2019《核酸檢測試劑盒質量評價技術規范》及CANS-CL02-A009:2018《醫學實驗室質量和能力認可準則在分子診斷領域的應用說明》相關要求對我們實驗室所用乙型肝炎病毒核酸檢測系統的精密度，準確度，檢測限及線性范圍進行評估。評估結果顯示：高濃度定值陽性樣本E7(1.0E+07)和低濃度定值陽性樣本E3(1.0E+03)，同批次分別重復檢測20次，計算批內精密度標準偏差分別為1.27%和1.32%；高低濃度陽性樣本每天重復檢測4次，連續檢測5 d，計算批間精密度標準偏差分別為1.60%和2.50%。2020年度衛生部臨檢中心核酸檢測(病毒學)和河北省臨檢中心臨床核酸檢測HBV-DNA室間質評我們實驗室均滿分通過。我們實驗室結合慢性乙型病毒性肝炎防治指南和我們實驗室所用試劑盒檢測限，實驗室設定HBV-DNA的檢測范圍為2.0*102～1.0*107，最低檢測下限為200 U/ml。將實驗室收集到的臨床高濃度陽性樣本稀釋至200 U/ml，重復檢測20次，結果均能被檢測出有效數據。再將高濃度陽性標本倍比稀釋，計算得到線性相關系數R2=0.99，>0.98，現用檢測試劑測量范圍線性關系良好。

為保證檢測質量，更好地為臨床為患者服務，任何檢測系統在使用前均應進行方法學的性能驗證。特別是在醫學臨床檢驗中，檢測結果的準確與否直接影響到患者的健康，嚴重者會危害到患者生命，所以檢測系統的性能驗證在檢測工作中非常重要。臨床實驗室應根據各自檢測項目的特點制訂一套有效可行的適合自己實驗室的性能驗證方案。