miR-30a-5p調控USP22對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響

姜永寧

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的神經退行性疾病，主要發生于>60歲人群。PD的主要病理改變為中腦黑質致密部多巴胺能神經元丟失和殘存神經元胞內α-突觸核蛋白聚集沉積。研究認為，PD黑質多巴胺能神經元變性中存在細胞凋亡現象，凋亡是PD多巴胺能神經元死亡的主要機制[1]，降低神經細胞凋亡對于PD疾病的治療具有積極意義。1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)是一種常用的多巴胺神經元毒素，其誘導多巴胺能神經元凋亡已廣泛用于PD的體外細胞模型研究[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為18～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，可與靶基因mRNA的3’非翻譯區(3’untranslated region，3’UTR)靶向結合，抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA，從而在轉錄后水平調控基因的表達，參與PD的發生發展過程[3,4]。研究顯示，經左旋多巴治療后的PD患者血清中miR-30a-5p的表達水平顯著上調，miR-30a-5p可能是PD的潛在生物標記物[5]。但miR-30a-5p與PD的具體關系及調控機制還未被闡明。Starbase生物信息學軟件預測顯示，泛素特異性蛋白酶22(ubiquitin specific protease 22，USP22)的3’UTR與miR-30a-5p的核苷酸序列存在連續的結合位點，提示USP22可能是miR-30a-5p的靶基因。USP22屬于DUBs家族，參與組蛋白去泛素化、乙酰化進而參與hSAGA復合物所調節的基因轉錄與表達等。目前認為USP22是腫瘤標志物，與腫瘤復發、轉移及預后密切相關[6]，其在PD中的作用筆者還未見相關報道。本研究旨在探討miR-30a-5p對MPP+誘導的人神經母細胞瘤(SK-N-SH)細胞增殖和凋亡的影響及其能否通過調控USP22影響MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡，以期為PD的靶向分子治療提供新途徑。報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人神經母細胞瘤SK-N-SH細胞購自中國科學院上海細胞庫，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Hycolne公司，DMEM培養基購自北京索萊寶科技有限公司，細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒、膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，Trizol試劑和LipofectamineTM 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司，PCR引物購自上海生工生物工程有限公司，細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自美國Santa Cruz公司，miR-30a-5p 模擬物(mimcs)及模擬陰性對照序列(miR-NC)、miR-30a-5p抑制劑(anti-miR-30a-5p)及抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC)、USP22的小干擾RNA(si-USP22)及亂序無意義陰性序列(si-NC)、USP22過表達載體(pcDNA-USP22)及空載體(pcDNA-NC)購自上海吉凱基因化學技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與轉染:SK-N-SH細胞用含10% FBS的RPMI 1640培養基培養。培養箱條件：溫度37℃、CO2體積分數5%、濕度97%。每2～3天更換一次新鮮的培養基。待細胞生長密度至80%時，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例進行傳代培養。取對數生長期的SK-N-SH細胞，以每孔1×105個細胞接種于6孔板中。待細胞生長密度至60%時，更換不含FBS的DMEN培養基。參照LipofectamineTM 2000試劑盒說明書，分別將miR-30a-5p mimcs(miR-30a-5p 組)、miR-NC(miR-NC組)、anti-miR-30a-5p(anti-miR-30a-5p組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、si-USP22(si-USP22組)、si-NC(si-NC組)、miR-30a-5p mimcs與pcDNA-USP22(miR-30a-5p+pcDNA-USP22組)及miR-30a-5p mimcs與pcDNA-NC(miR-30a-5p+pcDNA-NC組)轉染至SK-N-SH細胞。轉染6 h后，更換含10%FBS的DMEM培養基。繼續培養至48 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞分組處理:未轉染的SK-N-SH細胞分為對照組(NC組)和MPP+組，每組3個復孔，NC組細胞正常培養，MPP+組細胞采用含1 mmol/L[7]MPP+的培養基作用24 h。miR-30a-5p組、miR-NC組、si-USP22組、si-NC組、miR-30a-5p+pcDNA-USP22和miR-30a-5p+pcDNA-NC組細胞均用含1 mmol/L MPP+的培養基作用24 h，每組3個復孔，并分別記為MPP++miR-30a-5p組、MPP++miR-NC組、MPP++si-USP22組、MPP++si-NC組、MPP++miR-30a-5p +pcDNA-USP22和MPP++ miR-30a-5p+pcDNA-NC組。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測細胞中miR-30a-5p和USP22 mRNA表達:Trizol試劑提取各組細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度，其在260 nm和280 nm處吸光度值(absorbance，A)的比值A260 nm/A280 nm處于1.8～2.0范圍內說明其純度較好，可用于擴增。參照逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA后，進行PCR擴增。擴增條件：95℃預變性10 min，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共進行35個循環。引物序列：miR-30a-5p正向引物5’-CGTAGAGCTGATCGACGATG-3’，反向引物5’-GTG TCACCGTAACGTGACG-3’；USP22正向引物5’-TTCACCAGACCAGAGCACTT-3’，反向引物5’-CATACGTGGTGATCTTCCGC-3’；U6正向引物5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGCAGC-3’，反向引物5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；β-actin正向引物5’-GCCGGGACCTGACT GACTAC-3’，反向引物5’-CGGAGTACTTGCGCTCAGGA-3’。miR-30a-5p以U6為內參，USP22以β-actin為內參，2-ΔΔCt法計算miR-30a-5p和USP22 mRNA的相對表達水平。

1.2.4 Western Blot法檢測細胞中USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達:細胞以每孔2.5×104個接種于24孔板中，按照1.2.2分組處理后，吸棄培養基，加入RIPA細胞裂解液充分裂解細胞，提取細胞中總蛋白。BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度后進行定量，以每泳道30 μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結束后，濕轉至聚偏乙烯二氟(PVDF)膜，并置于5%脫脂奶粉中封閉2 h。分別置于USP22、CyclinD1、Cleaved-caspase-3和β-actin抗體孵育液中，4℃冰箱孵育過夜。TBST洗膜后，置于辣根過氧化酶標記的二抗孵育液中，37℃孵育1 h。TBST洗膜后，滴加ELC化學發光試劑，避光顯影后凝膠成像系統曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8檢測細胞存活率:細胞以每孔0.5×104個接種于96孔板中，按照1.2.2分組處理后，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續孵育4 h后酶標儀490 nm處測定A。細胞存活率(%)=A實驗組/ANC組×100%。實驗重復3次。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡:細胞以每孔2.5×104個接種于24孔板中，按照1.2.2分組處理后，吸棄培養基，胰蛋白酶消化，收集細胞，適量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗2次。取1.0×106個細胞，加入500 μl結合緩沖液。混懸細胞后，加入10 μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10 min。加入5 μl PI，室溫避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-30a-5p與USP22靶向關系:PCR擴增含miR-30a-5p結合位點的USP22的3’UTR序列，將其克隆至GV272載體中，構建USP22野生型雙熒光素酶報告質粒(WT-USP22)。利用基因突變技術將結合位點突變后，同樣克隆至GV272載體中，構建USP22突變型雙熒光素酶報告質粒(MUT-USP22)。分別將WT-USP22、MUT-USP22與miR-30a-5p mimic、miR-NC共轉染至SK-N-SH細胞。轉染6 h后，更換含10%FBS的DMEM培養基。繼續培養至48 h后，收集細胞并裂解，參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 MPP+對SK-N-SH細胞中miR-30a-5p和USP22表達的影響 與NC組比較，MPP+組細胞中miR-30a-5p表達水平顯著降低(P<0.05)，USP22 的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western Blot檢測MPP+誘導SK-N-SH細胞后USP22蛋白表達

表1 MPP+對SK-N-SH細胞中miR-30a-5p和USP22表達的影響

2.2 上調miR-30a-5p對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響 與NC組比較，MPP+組細胞存活率和CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與MPP++miR-NC組比較，MPP++miR-30a-5p組細胞存活率和CyclinD1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 上調miR-30a-5p對MPP+誘導的SK-N-SH細胞細胞凋亡及相關蛋白表達的影響;A 流式細胞儀檢測細胞凋亡；B Western Blot檢測CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表達

表2 上調miR-30a-5p對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

2.3 下調USP22對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響 與MPP++si-NC組比較，MPP++si-USP22組細胞存活率和CyclinD1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見表3，圖3。

表3 下調USP22對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

圖3 Western Blot檢測USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達

2.4 miR-30a-5p靶向USP22表達 Starbase生物信息學軟件預測顯示，USP22的3’UTR與miR-30a-5p的核苷酸序列存在連續的結合位點。雙熒光素酶活性檢測結果顯示，與共轉染WT-USP22的miR-NC組比較，共轉染WT-USP22的miR-30a-5p組細胞雙熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而與共轉染MUT-USP22的miR-NC組比較，共轉染MUT-USP22的miR-30a-5p組細胞雙熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。與miR-NC組比較，miR-30a-5p組細胞中USP22蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-30a-5p組細胞中USP22蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4，表4、5。

圖4 miR-30a-5p靶向USP22表達;A miR-30a-5p和USP22的結合位點；B Western Blot檢測USP22蛋白表達

表4 雙熒光素酶活性檢測結果

表5 miR-30a-5p對USP22蛋白表達的影響

2.5 上調USP22逆轉miR-30a-5p對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響 與MPP++miR-30a-5p+pcDNA-NC組比較，MPP++miR-30a-5p+pcDNA-USP22組細胞存活率和CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 Western Blot檢測USP22、CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達

表6 上調USP22逆轉上調miR-30a-5p對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

3 討論

PD的發病率僅次于阿爾茨海默病，是第二大神經退行性疾病，其病因和發病機制目前尚不明確[8]。PD的特征性病理改變是中腦黑質致密部多巴胺能神經元的變性和壞死，延緩多巴胺能神經元的變性可阻止PD發展進程。研究顯示，多巴胺能神經元的過度凋亡引起帕金森病的中心環節，多種病因最終都是引起細胞凋亡導致帕金森發病[9]。MPP+具有神經毒性，可誘導多巴胺神經元的凋亡，常被用于體外帕金森細胞模型研究。本研究顯示，MPP+誘導SK-N-SH細胞后，細胞增殖能力降低，凋亡率升高，與相關報道結果[10]一致，說明MPP+抑制SK-N-SH細胞增殖，并促進細胞凋亡。

miRNA在真核生物中廣泛存在，參與調控細胞的增殖、凋亡等生物學行為，在人類多種疾病的發生發展中起重要作用。miR-30a-5p屬于miR-30家族成員，目前對其研究主要集中在腫瘤方面。研究顯示，miR-30a-5p在非小細胞肺癌、胰腺癌、皮膚鱗狀細胞癌等腫瘤中表達降低，上調其表達可降低腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲等，是腫瘤治療的潛在分子靶點[11-13]。然而，miR-30a-5p在PD發生發展中的作用和調控機制還未知。CyclinD1是細胞周期相關蛋白，其表達增殖可加速細胞周期進程，促進細胞增殖[14]。本研究顯示，上調miR-30a-5p后，MPP+誘導SK-N-SH細胞存活率和CyclinD1蛋白表達升高，上調miR-30a-5p可能通過上調CyclinD1蛋白表達促進MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖。Caspase級聯反應參與細胞凋亡過程。caspase-3是caspase級聯反應的重要分子，其受到上游信號刺激被激活后產生級聯效應，誘導細胞凋亡[15]。本研究顯示，上調miR-30a-5p后，MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達顯著降低，提示上調miR-30a-5p可能通過抑制細胞中Cleaved-caspase-3蛋白表達降低MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡。

USP22基因定位于人染色體17p11.2，由14個外顯子組成，其編碼蛋白表達于細胞核。研究顯示，USP22在非小細胞肺癌和胃癌等腫瘤中表達升高，下調其表達可顯著降低了胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力[16,17]。高糖可促進足細胞中USP22表達，上調USP22表達可明顯增強高糖誘導的足細胞凋亡和炎性反應[18]。目前，USP22對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究顯示，MPP+可促進SK-N-SH細胞中USP22的mRNA和蛋白表達，下調USP22可促進MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖，同時抑制細胞凋亡，提示USP22可能參與PD的發生和發展過程。

為了進一步探究上調miR-30a-5p促進MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖并抑制細胞凋亡的分子機制，本研究通過生物信息學軟件預測顯示，USP22可能是miR-30a-5p的靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-30a-5p可與USP22的3’UTR靶向結合。此外，SK-N-SH細中miR-30a-5p上調后，USP22蛋白表達水平降低，而下調miR-30a-5p后，USP22蛋白表達水平升高，進一步證實了miR-30a-5p在SK-N-SH細胞中靶向負調控USP22表達。本研究還顯示，上調USP22逆轉了上調miR-30a-5p對MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖和凋亡的影響，提示上調miR-30a-5p通過靶向抑制USP22表達促進MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖及抑制細胞凋亡。

綜上所述，MPP+可抑制SK-N-SH細胞增殖，并誘導細胞凋亡，而上調miR-30a-5p表達可促進MPP+誘導的SK-N-SH細胞增殖及降低MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡，作用機制可能與下調細胞中USP22表達有關，miR-30a-5p/USP22軸可能為PD的治療提供了潛在分子靶點。