超聲波輔助水酶法提取棕櫚油工藝優化及其成分分析

高 淼，馬曉軍

(天津科技大學輕工科學與工程學院，天津 300457)

棕櫚(Trachycarpus fortune(Hook.)H.Wendl.)屬棕櫚科屬直立喬木狀植物，是熱帶本木油料作物，原產非洲熱帶地區，是目前世界上產油生產效率最高的植物.從棕櫚果中榨取棕櫚油，含油量可達 50%以上.棕櫚的單位面積最高產油量是大豆的 8倍，菜籽的10倍，故被人們譽為“世界油王”[1].在棕櫚油中，主要的脂肪酸是棕櫚酸和油酸.就穩定性而言，由于天然抗氧化劑的存在，棕櫚油是抗氧化能力最強的植物油之一[2].它的脂肪酸組成為 50%飽和脂肪酸、40%單不飽和脂肪酸和 10%多不飽和脂肪酸.由于棕櫚油在室溫下呈半固態，因此廣泛應用于食品、醫療、日用品加工等行業[3].

目前，植物油的提取方法主要為傳統的壓榨法和有機溶劑浸提法.然而，傳統的壓榨法機械設備復雜耗能大、殘油率高，且蛋白質在榨油過程中變性嚴重[4].有機溶劑浸提法提油，成品油中會有微量有機溶劑殘留，污染環境且危害人體[5].水酶法作為一種新興的植物油脂和蛋白質提取技術，利用酶解和機械方式破壞植物原料細胞壁和脂蛋白、脂多糖等，使蛋白質水解為小分子肽，油脂從物料中分離出來[6].另外，溫和的工藝條件還可以使油脂、蛋白質、膠質等保持良好的營養價值和功能性質[7].此種提取油脂的方法操作簡單、提油率高、工藝條件溫和[8]、合乎綠色可持續發展的要求，且避免了對油脂和蛋白質的嚴重破壞[9]，近年來受到越來越多研究者的關注.

雖然酶可以促進細胞壁降解從而改善油脂通過膜的滲透性，但是利用水酶法提取油脂工藝的生產效率仍然低于常規方法；若通過超聲波輔助水酶法，則能夠進一步提高滲透性[10-13].超聲波輔助水酶提取油脂工藝主要是通過超聲波在物料中迅速集中和擴散，讓液體產生空化效果，是傳統提取方法的先進輔助技術，普遍應用于油脂提取工藝[14].特別是空化氣泡對于物料表面凹陷處產生的沖擊力和剪切力會破壞物料細胞結構[5]，與此同時，還可利用超聲波具有的化學效應、機械振動、熱效應等多種次級效應[15]，促進物料中棕櫚油和蛋白質等有效成分的擴散，提高棕櫚油提取率[16].

本研究以棕櫚果為原料，利用超聲波輔助水酶法提取棕櫚油，探究了液料比、酶添加量、酶解溫度對棕櫚油提取率的影響，并運用響應面設計優化其工藝參數，同時進行了 GC-MS實驗對其化學成分進行分析與鑒定.

1 材料與方法

1.1 材料

棕櫚果，由海南熱帶農業發展研究所提供；CTec2纖維素酶(酶活性 1000 BHU-2/g)，諾維信生物技術有限公司.

FZ102型微型植物試樣粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；ZNCL-B型智能磁力攪拌器，天津科諾儀器設備有限公司；TD3102型電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；KQ-500DE型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；H1650型離心分離機，湘儀離心機儀器有限公司；QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)，日本島津儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 超聲波輔助水酶法提取棕櫚油工藝

取一定量的棕櫚果用粉碎機粉碎后，將棕櫚果渣(質量為 m0)按一定的液料比進行調制.將制備好的溶液放入超聲波清洗機中超聲 30min，超聲溫度40℃，超聲功率 400W.超聲處理結束后的溶液于100℃沸水中滅菌 10min，冷卻至室溫后加入一定量的纖維素酶，在一定溫度下酶解 2h，酶解的同時不斷攪拌，攪拌速率 500r/min；酶解結束后沸水浴10min滅酶.酶解液冷卻至室溫后 7000r/min離心7min，得到上層清油 a、乳狀液、水解液、廢渣，取水解液留存備用.取離心后的乳狀液于－20℃冷凍18h，然后于 50℃解凍破乳 2h，解凍后將乳狀液7000r/min離心 7min，收集上層清油 b.合并兩次離心得到的上層清油(質量分別為 ma和 mb)，根據式(1)計算棕櫚油提取率.

1.2.2 單因素實驗設計

根據 1.2.1節所述的超聲波輔助水酶法，分別以液料比、酶添加量、酶解溫度為單因素探究對棕櫚油提取率的影響，單因素水平設計：液料比(g∶mL)4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1，酶添加量為棕櫚果渣物料總質量的 2%、3%、4%、5%、6%，酶解溫度 30、40、50、60、70℃.每個單因素實驗平行重復 3次，結果取平均值.

1.2.3 響應面優化實驗設計

以單因素實驗為基礎，綜合實驗結果和經濟效益，選擇液料比(A)、酶添加量(B)、酶解溫度(C)為因素，提取率(Y)為響應值，利用 Design Expert 8.0.6軟件進行 Box-Behnken中心組合實驗設計和響應面分析.

1.2.4 棕櫚油油脂脂肪酸GC-MS分析

樣品前處理：稱取 900mg油脂樣品于比色管中，加入2mL 5% KOH-甲醇溶液，置于40℃水浴中反應20min；待反應完成后，冷卻至室溫并加入2mL正己烷溶解試樣，然后轉移到 10mL容量瓶中定容；靜置24h后吸取上層有機相過0.45μm濾膜，置于進樣小瓶中，待進行GC-MS分析.

氣相色譜條件：毛細管色譜柱為 HP-INNOWAX型石英毛細管柱，進樣口溫度 280℃，樣品進樣量0.4μL.升溫程序：初始溫度 80℃，保留 1min；以10℃/min的升溫速率升溫到200℃；然后以5℃/min的升溫速率升溫到250℃；最后以2℃/min的升溫速率升溫到 270℃，保留 5min；整個升溫程序運行的時間為36min.

質譜條件：采用 EI離子源，離子源溫度 230℃，溶劑延時5min，電子能量70eV，分辨率1000.

對上述檢測的色譜峰采用 NIST05標準譜庫對分析的樣品進行峰匹配，逐一對應進行定性分析，采用面積歸一法進行定量分析.

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 液料比對棕櫚油提取率的影響

在酶添加量為 4%、酶解溫度為 40℃的條件下，液料比對棕櫚油提取率的影響如圖1所示.隨著液料比的增加，棕櫚油提取率緩慢增加，當液料比超過8∶1時，棕櫚油提取率迅速下降.這可能是由于體系中液料比較小的時候，整個體系黏度過大，影響酶和底物的流動性，不利于油脂的分離；當液料比過大時，降低了酶和底物的濃度，減小了酶分子與底物分子碰撞概率，不利于酶解充分.因此，選擇8∶1為最佳液料比進行優化實驗.

圖1 液料比對棕櫚油提取率的影響Fig.1 Effect of ratio of material to liquid on the extraction rate of palm oil

2.1.2 酶添加量對棕櫚油提取率的影響

在液料比為 8∶1、酶解溫度為 40℃的條件下，酶添加量對棕櫚油提取率的影響如圖2所示.

圖2 酶添加量對棕櫚油提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosageon the extraction rate of palm oil

從圖2可知：棕櫚油提取率隨酶添加量的增加而升高，當酶的添加量達到 4%時棕櫚油提取率最高；隨著酶添加量繼續增加，提取率開始呈現下降趨勢.分析原因可能是：酶添加量越多，對細胞結構破壞越大，對脂蛋白等復合體酶解更充分，從而促進油脂從脂質體膜中釋放出來；但是當酶添加量超過一定范圍時，酶對脂蛋白作用達到飽和，限制了酶解效果，因此選擇酶添加量為4%.

2.1.3 酶解溫度對棕櫚油提取率的影響

在液料比為 8∶1、酶添加量為 4%的條件下，酶解溫度對棕櫚油提取率的影響如圖3所示.在起始階段，隨著溫度的升高，棕櫚油的提取率呈現先增加后減少的趨勢，在 40℃時出現最大值；當溫度超過50℃時，提取率隨溫度升高迅速下降.分析原因可能是：隨著溫度升高，酶活性提高，加速了分子的熱運動，使細胞內的可溶性物質更好地與酶接觸；當超過酶適宜溫度，酶的活性降低，使酶部分甚至全部失去催化活性，同時會導致部分油脂水解成脂肪酸，降低了游離油的提取率.因此，選擇酶解溫度為40℃.

圖3 酶解溫度對棕櫚油提取率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of palm oil

2.2 響應面實驗及顯著性檢驗

2.2.1 Box-Behnken中心組合實驗設計

以單因素實驗為基礎，選擇液料比(A)、酶添加量(B)、酶解溫度(C)為因素，提取率(Y)為響應值，響應面設計及結果見表1，實驗號 1、4、8、14、16 是5個中心實驗，用來測試實驗誤差，其余是析因實驗.響應面二次回歸模型方差分析結果見表2.

表1 響應面設計及結果Tab.1 Response surface test design and results

表2 方差分析結果Tab.2 Results of variance analysis

以棕櫚油提取率(Y)為響應值，對表1數據通過Design Expert 8.0.6 軟件進行多元回歸擬合，建立響應面二次回歸模型為

由表2可知：整體模型的F＝95.27，P＜0.0001，此模型回歸項極顯著，回歸模型的自變量和因變量存在顯著的線性關系，說明這是一種可靠的實驗方法.

失擬項 F＝3.14，P＝0.1490，失擬項不顯著，說明此模型是正確的選擇.模型相關系數 R2＝99.19%，說明該回歸方程與實驗具有很好的擬合性，調整系數 R2Adj＝98.15%，表明 98.15%的響應值變化能夠利用模型進行解釋.由 F值檢驗可以判斷各個因素的影響力為 C＞A＞B，即酶解溫度＞液料比＞酶添加量.

2.2.2 響應面分析與最優條件的確定

使用Design Expert 8.0.6軟件對上述二次回歸模型分別作出2D等高線圖和3D曲面圖，如圖4所示.等高線的形狀判斷不同影響因素之間的交互作用是否顯著：橢圓形或馬鞍形表示顯著，圓形表示不顯著.由圖4可知：棕櫚油提取實驗中，液料比、酶添加量和酶解溫度相互兩個影響因素的等高線圖呈明顯的橢圓形，說明3個因素兩兩之間的交互作用較為顯著.

圖4 各因素對棕櫚油提取率交互作用的響應面和等高線圖Fig.4 Contour response surface plots for the interactive effects of three factors on palm oil yields

棕櫚油提取率隨液料比和酶添加量的變化呈先升高后降低的趨勢(圖4(a)).當酶添加量一定時，棕櫚油提取率隨著酶解溫度的升高而升高，隨后有所下降(圖4(b)).同時，酶解溫度對棕櫚油提取率有二次影響，棕櫚油提取率升高到酶解溫度為 42.43℃后下降.在較高溫度下預處理的生物質中，棕櫚油提取率的下降幅度較大.當酶解溫度一定時，隨著液料比的增大，油脂提取率升高到一定程度后逐漸降低；而當液料比一定時，油脂提取率隨酶解溫度的變化呈先升高后降低的趨勢(圖4(c)).

利用模型方程可以預測超聲波輔助水酶法提取棕櫚油的最佳工藝條件是液料比 8.2∶1、酶添加量4.2%、酶解溫度 42℃，在此條件下棕櫚油提取率為34.67%.為進一步考察模型的準確性，在最佳條件下進行了 3次平行實驗，得到棕櫚油的平均提取率是34.62%，與理論預測值接近，說明回歸模型方程和實際情況有較好的擬合性.

2.3 GC-MS分析

通過 GC-MS實驗對超聲輔助水酶法提取出的棕櫚油成分進行檢測(圖5)，使用峰面積歸一化的方法對其進行含量鑒定.

圖5 棕櫚油油脂 GC-MS 總離子流色譜圖Fig.5 Total ion current chromatogram of fatty acids in palmoil

利用質譜數據庫進行檢索，同時采用人工譜圖進行解析，脂肪酸的組成及相對含量分析見表3.由表3可知：從棕櫚油中共檢測出了 8種脂肪酸成分，其中油酸為不飽和脂肪酸，相對含量為29.56%；飽和脂肪酸共7種，棕櫚酸相對含量為34.91%.

表3 棕櫚油脂脂肪酸組成及相對含量分析Tab.3 Fatty acid composition and relative content analysis of palm oil

3 結 語

以棕櫚果為原料，利用超聲輔助水酶法提取棕櫚油，采用單因素實驗和 Box-Benhnken實驗設計及響應面分析方法，對超聲波輔助水酶法提取棕櫚油的工藝進行優化實驗，得到提取棕櫚油的最佳工藝條件為：液料比 8.2∶1、酶添加量 4.2%、酶解溫度42℃.在該最佳條件下，得到棕櫚油的平均提取率為34.62%.各因素對棕櫚油提取率影響的顯著程度依次為酶解溫度、液料比、酶添加量，并得到棕櫚油提取率和每個因素的二次回歸方程模型，此模型的回歸性非常顯著，較于實驗的擬合性很高，說明超聲波輔助水酶法可以有效地提取油脂.通過GC-MS實驗對水酶法提取的棕櫚油成分進行分析鑒定，共檢測出 8種脂肪酸，其中，棕櫚酸和油酸含量較高.

本實驗只使用了 CTec2纖維素酶，后續研究中可以進一步探究蛋白酶、糖化酶等對其酶解效果的影響；還可以以棕櫚果水解液和棕櫚油全組分有機酸為碳源調控合成 PHA，為尋找廉價的碳源、降低 PHA生產成本提供理論依據.