熱處理改性燕麥蛋白部分性質(zhì)與表面疏水性的關(guān)系

許英一，劉迪，林巍，吳紅艷，王宇

1. 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（齊齊哈爾 161006）；2. 黑龍江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)分院（齊齊哈爾 161005）

燕麥中蛋白質(zhì)含量為11.19%～19.85%，其氨基酸均衡且比例穩(wěn)定，籽粒中蛋白含量明顯高于其他谷物[1]。燕麥蛋白是一種低過敏性的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，具有良好的營養(yǎng)特性，適合應(yīng)用于食品行業(yè)。但由于燕麥蛋白中球蛋白含量在50%～60%之間，溶解性較差，在一定程度上制約了乳化性、起泡性等其他功能特性，限制了其應(yīng)用[2]。熱處理是食品加工的常用方式，主要通過對蛋白熱聚集行為的影響達(dá)到影響其功能性質(zhì)及生物有效利用率的目的，從而拓寬其在食品工業(yè)中作為配料應(yīng)用的范圍。有研究發(fā)現(xiàn)熱處理是提高大豆蛋白功能特性如乳化性、起泡性、凝膠性的重要方式[3-4]。

蛋白質(zhì)的疏水作用是配位體間的非共價(jià)鍵相互作用，對蛋白質(zhì)的功能及穩(wěn)定性等有重要意義。表面疏水性是衡量分子間相互作用強(qiáng)弱的重要參數(shù)，不僅與加工方法及條件有關(guān)，還與蛋白質(zhì)的性質(zhì)密切相關(guān)[5]。許晶等[6]研究大豆分離蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白的表面疏水性與溶解性呈負(fù)相關(guān)，與巰基含量呈正相關(guān)。樊永華[7]在研究改性醇法大豆?jié)饪s蛋白結(jié)構(gòu)與功能性的相關(guān)性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)氨處理醇法大豆?jié)饪s蛋白的表面疏水性與溶解性、乳化性呈極顯著的線性正相關(guān)。但關(guān)于燕麥蛋白性質(zhì)與表面疏水性的關(guān)系研究在國內(nèi)外還鮮有報(bào)道。此次研究對堿溶酸沉法提取的燕麥蛋白進(jìn)行熱處理改性，并測定其表面疏水性、巰基含量、熒光光譜分析、溶解性、乳化性，從而探究多種性質(zhì)與表面疏水性的關(guān)系，為改善燕麥蛋白性質(zhì)和拓展其應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

燕麥，由黑龍江省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)分院實(shí)驗(yàn)基地提供；8-苯胺基-1-萘磺（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS），美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、尿素、2-硝基苯甲酸（DTNB）等均為分析純。

TDL-5-A臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；722S可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市醫(yī)療器械廠；RF530PC熒光分光光度計(jì)，日本島津；SHA-C水浴恒溫振蕩器，金壇市天竟實(shí)驗(yàn)儀器廠；CR21G日立高速冷凍離心機(jī)，日立（日本）公司；ALPHA1-4/LSC真空冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 燕麥蛋白的制備[8]

采用堿溶酸沉法提取燕麥蛋白。

1.2.2 熱處理改性燕麥蛋白

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的燕麥蛋白的Tris-HCl緩沖溶液（0.01 mol/L、pH 9）。室溫下攪拌2 h，水化過夜，離心去除不溶性蛋白后得到上清蛋白溶液，記為OP。上清蛋白溶液分別在60，80和100 ℃水浴鍋中加熱30 min后冷卻、凍干，得到的產(chǎn)物分別記作OP1，OP2和OP3。

1.2.3 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法進(jìn)行表面疏水性指數(shù)的測定[9]，并略有改動。配制燕麥蛋白質(zhì)量濃度為0.4 g/L的磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 7），按4000 r/min離心10 min，收集上清液。測定上清液中可溶性蛋白濃度，稀釋樣品溶液得系列濃度為0.00125，0.0025，0.005，0.01和0.02 g/L的樣品溶液。取4 mL系列稀釋溶液和20 μL 8 mmol/LANS溶液（8-苯胺基-1-萘磺酸）漩渦混合，在室溫下避光反應(yīng)15 min，測定混合液的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長及發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm（狹縫寬5 nm），同時(shí)以未加入ANS溶液的蛋白溶液熒光強(qiáng)度為空白，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，線性回歸曲線初始斜率就是蛋白質(zhì)的表面疏水性指數(shù)（S0）。

1.2.4 巰基含量的測定

表面巰基含量的測定：采用Tris-甘氨酸緩沖液（Tris 0.086 mol/L，甘氨酸0.09 mol/L，EDTA 4 mmol/L，pH 8.0）制備質(zhì)量濃度為2 mg/mL的蛋白樣品，取6 mL蛋白樣品，加入0.02 mL Ellman’s 試液（0.2 g DTNB溶于50 mL緩沖液中）。室溫反應(yīng)15 min，按4000 r/min離心10 min，上清液在412 nm下測定吸光度，未添加試樣的則作空白[10]。

游離巰基含量的測定：將燕麥蛋白用Tris-甘氨酸緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，4 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0）配制成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的蛋白樣品，后面步驟完全同表面巰基的測定方法。巰基含量（μmol/g）根據(jù)式（1）計(jì)算。

式中：73.53=106/（1.36×104），1.36×104為Ellman’s試劑的摩爾消光系數(shù)，L/（mol·cm）；A412為加DTNB時(shí)樣品的吸光度；D為稀釋系數(shù)；C為樣品的質(zhì)量濃度，mg/mL。

巰基暴露程度按式（2）計(jì)算。

1.2.5 內(nèi)源熒光光譜分析

參照王中江等[11]的測定方法。蛋白分散于pH 7磷酸鹽緩沖液中，蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，激發(fā)波長為295 nm，發(fā)射光譜范圍300～400 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm，以未加樣品的磷酸鹽緩沖液為空白。

1.2.6 溶解性的測定

參照李開放等[12]的測定方法并稍做修改。稱取0.25 g樣品溶于25 mL蒸餾水中，在室溫下水浴振蕩30 min后離心（4000 r/min，30 min）。用移液管取3 mL上清液于另一試管中，加入2 mL雙縮脲試劑，混合均勻，靜置10 min，再次離心，取上清液用722分光光度計(jì)測定在540 nm處的吸光度，根據(jù)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液的蛋白含量。同時(shí)，凱氏定氮測定燕麥蛋白中的總蛋白含量，溶解度定義為上清液中蛋白濃度與總蛋白濃度的比值。

1.2.7 乳化性的測定

參照李翠翠等[13]的測定方法并稍作改動。將蛋白溶于0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液，配制30 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的燕麥蛋白溶液，加入10 mL大豆色拉油，按10000 r/min均質(zhì)1 min。分別在0和10 min時(shí)從容器底部移取50 μL乳狀液，加到5 mL的0.1%的SDS溶液中，以0.1%的SDS溶液做空白，在500 nm處測其吸光度。乳化活性指數(shù)EAI（m2/g）通過公式（3）計(jì)算：

式中：DF為稀釋倍數(shù)；C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL；Φ為乳液中油相所占的體積分?jǐn)?shù)，0.25%；L為比色池光徑，1 cm。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和處理采用SPSS V21.0軟件和Excel軟件。

2 結(jié)果與討論

以未改性的OP為對照，測定熱處理改性（OP1、OP2和OP3）和未改性O(shè)P的巰基、熒光光譜特性、溶解性、乳化性及表面疏水性等性質(zhì)。主要考察利用熱處理進(jìn)行改性的燕麥蛋白部分性質(zhì)與表面疏水性之間的相關(guān)性。

2.1 熱處理改性燕麥蛋白表面疏水性分析

熱處理改性對燕麥蛋白表面疏水性的影響如圖1所示。與原蛋白相比，熱處理改性燕麥蛋白的表面疏水值顯著增加（p=0.018＜0.05）。在相同濃度條件下，隨著熱處理溫度的升高，表面疏水指數(shù)大幅升高，在100 ℃時(shí)（OP3）表面疏水指數(shù)達(dá)到最高，為218.37±3.45。這可能是因?yàn)檫m當(dāng)熱處理破壞了燕麥蛋白分子內(nèi)部的疏水相互作用，蛋白質(zhì)之間分子鏈展開，暴露出了更多的疏水基團(tuán)，因此表面疏水性增加。

圖1 熱處理改性燕麥蛋白的表面疏水性

2.2 巰基含量與表面疏水性的相關(guān)性分析

熱處理改性燕麥蛋白表面巰基含量、巰基暴露程度與表面疏水性的相關(guān)性分析如圖2和圖3所示。相關(guān)性分析表明：表面疏水性與游離巰基含量的相關(guān)系數(shù)r為0.084，r＜r0.05（0.632），表面疏水性和表面巰基含量的相關(guān)系數(shù)r為0.959，r＞r0.01，表面疏水性和巰基暴露程度相關(guān)系數(shù)r為0.806，r＞r0.01，說明表面疏水性和游離巰基含量相關(guān)性不顯著，但與表面巰基含量、巰基暴露程度呈極顯著的線性正相關(guān)關(guān)系，這與李丹等[14]不同大豆品種11S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性關(guān)系研究結(jié)果一致。

圖2 表面巰基濃度與表面疏水性的相關(guān)性分析

圖3 巰基暴露程度與表面疏水性的相關(guān)性分析

2.3 內(nèi)源熒光強(qiáng)度與表面疏水性的相關(guān)性分析

熱處理改性燕麥蛋白的內(nèi)源熒光發(fā)射光譜如圖4所示。在λmax相同（λmaxOP=λmaxOP1=λmaxOP2=321 nm）的情況下，色氨酸殘基暴露程度越大，熒光強(qiáng)度越高，其表面疏水性就越高。由圖4可知，在同一波長下，熱處理溫度80 ℃燕麥蛋白（OP2）比熱處理溫度60 ℃燕麥蛋白（OP1）的熒光強(qiáng)度低，分析原因可能是熱處理溫度升高會導(dǎo)致燕麥蛋白的柔性增加，從而使更多的發(fā)色團(tuán)暴露于試劑中發(fā)生熒光猝滅，所以熒光強(qiáng)度降低。但100 ℃熱處理的燕麥蛋白（OP3）熒光強(qiáng)度最大，可能是因?yàn)闊崽幚頊囟壤^續(xù)升高使燕麥蛋白分子形成較大聚集體所致，這與王健等[15]的研究結(jié)果相一致。熱處理改性燕麥蛋白色氨酸殘基相對熒光強(qiáng)度與表面疏水性的相關(guān)性分析如圖5所示，色氨酸殘基相對熒光強(qiáng)度與表面疏水性的相關(guān)系數(shù)r為0.819，r＞r0.01，兩者呈極顯著的正相關(guān)。

圖4 內(nèi)源熒光光譜分析

圖5 內(nèi)源熒光強(qiáng)度與表面疏水性的相關(guān)性分析

2.4 溶解性與表面疏水性的相關(guān)性分析

熱處理改性燕麥蛋白的溶解性與表面疏水性的相關(guān)性分析如圖6所示。二者之間的相關(guān)系數(shù)r為0.939，r＞r0.01，表明兩者呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系。Bigelow[16]認(rèn)為溶解性本身受到表面疏水性和電荷頻率兩個(gè)參數(shù)的影響，高電荷頻率、低表面疏水性可以有效提高溶解度。但此次試驗(yàn)通過熱處理改性，會同時(shí)改變電荷頻率、疏水性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使這種相關(guān)性不再存在。結(jié)果顯示，溶解度隨表面疏水性的增加而變大，這可能是由于電荷頻率對燕麥蛋白溶解度的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于表面疏水性的作用[17]。

圖6 溶解性與表面疏水性的相關(guān)性分析

2.5 乳化性與表面疏水性的相關(guān)性分析

熱處理改性燕麥蛋白的乳化性與表面疏水性的相關(guān)性分析如圖7所示。二者之間的相關(guān)系數(shù)r為0.820，r＞r0.01，表明兩者之間存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系。乳化性是指將油和水混合在一起形成乳狀液的性能，是蛋白質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)。蛋白質(zhì)的乳化性不僅與其分子的疏水性質(zhì)有關(guān)，還與疏水基團(tuán)在分子中的分布有關(guān)。熱處理改性使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，隱藏的疏水基團(tuán)逐漸暴露出來，表面疏水性變大有利于蛋白質(zhì)和油滴的結(jié)合，其乳化性得到改善[18]。

圖7 乳化性與表面疏水性的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

熱處理改性燕麥蛋白的表面巰基含量與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（r=0.959）、與巰基暴露程度呈極顯著正相關(guān)（r=0.806），而與游離巰基含量相關(guān)性不顯著。熱處理改性燕麥蛋白的色氨酸殘基相對熒光強(qiáng)度與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（r=0.819），即色氨酸殘基暴露程度越大，表面疏水性越高。熱處理改性燕麥蛋白的溶解性與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（r=0.939）、乳化性與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)（r=0.820）。