酶聯免疫法檢測牛乳中A1β-酪蛋白研究

艾正文

乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院（上海 200436）

牛乳中的蛋白質主要分為乳清蛋白和酪蛋白，其中酪蛋白約占牛乳中蛋白質的80%[1]。牛乳中的酪蛋白主要由as1-酪蛋白、as2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白組成。根據文獻資料顯示，發現的β-酪蛋白變異體達十幾種，較為常見的變異體為A1、A2、B和C。其中，又以A1和A2這2種變異體最為常見，其他變異體出現的概率很低。A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白的區別在于第67號位的氨基酸種類不同[2-3]。有研究表明，A1型β酪蛋白經消化后會產生一種含有7個氨基酸的短肽，即β-酪啡肽（BCM-7）[4-5]，而這種短肽可能會引起某些諸如過敏[6]、糖尿病[7]、消化吸收[8]等非傳染性疾病，而A2型β-酪蛋白則不會產生這種β-酪啡肽。通過基因測序手段可以實現A2基因型奶牛的有效篩選。近年來隨著A2牛奶及A2奶粉等乳制品的興起，A2乳制品的相關研究日漸增多。關于A1和A2蛋白檢測方法的研究越來越多，綜合研究發現乳制品中β-酪蛋白的檢測方法主要有液相法[9]、高分辨質譜法[10]、毛細管電泳法[11-12]及免疫學方法[13-14]等，但是這些方法在便利性、準確性及成本等方面存在一定程度不足。正是標準的檢測方法的缺失，如何快速檢測乳制品中A1蛋白成為需要重點解決的問題。

酶聯免疫法由于其方便和靈敏等優點，特別是在工業生產過程中由于其能夠在相對較短的時間內得到檢測結果，因此被廣泛應用到實際生產中。試驗對一種牛乳中A1β-酪蛋白含量的酶聯免疫檢測方法進行驗證，以探討該方法在實際應用的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通巴氏殺菌乳（O_PMilk，含有A1 & A2β-酪蛋白）；A2β-酪蛋白生牛乳（A2_RMilk，取自A2牧場）；A2β-酪蛋白鮮牛奶（A2_PMilk，采用質譜方法驗證）；鹽酸（化學純，國藥集團）；氫氧化鈉（化學純，國藥集團）；牛乳A1β-酪蛋白酶聯免疫試劑盒（biosensis）；去離子水。

1.2 儀器與設備

搖板機L079-100（Thermo）；移液器（Eppendorf）；酶標儀SpectraMax M5（Molecular Devices）；Milli-Q超純水儀（美國密理博公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 溶液的配制

將100 mL TBS（10X）加入900 mL去離子水中，充分混合并定容，用0.45 μm孔徑濾膜過濾得到TBS緩沖液（1X）。

取1 mL Tween-20溶液加入TBS緩沖液（1X）中，充分混合后得到TBST溶液，用于配制抗體稀釋液緩沖液和洗板溶液。

將100 mL TBST加入試劑盒中BSA瓶中充分混合，但不要過度混合，制備抗體和樣品Ab稀釋緩沖液。

標準品的制備：將試劑盒中標準品儲備液加入990 μL稀釋緩沖液，制成400 ng/mL A1標準品。逐漸稀釋配制成質量濃度200，100，50，25和12.5 ng/mL的A1標準品。稀釋好的標準溶液置于4 ℃條件下保存，于3 h內使用。

樣品的制備：將待測的普通巴氏殺菌乳樣品在0.5 mol/L NaOH中按照1∶100稀釋，用Ab稀釋緩沖液再稀釋至最終稀釋倍數1∶100000。同時，將待測的A2牛奶樣品稀釋至最終稀釋倍數1∶1000。稀釋的樣品在4 ℃條件下保存，并于3 h內完成測試。

1.3.2 標準曲線的建立

按照biosensis A1β-酪蛋白酶聯免疫檢測試劑盒說明書操作方法，將試劑盒中A1β-酪蛋白標準品配制成一定的濃度梯度，在450 nm條件下進行測定，以標準品的濃度梯度為橫坐標，標準品的吸光度為縱坐標，構建四參數曲線，得到線性回歸方程。

1.3.3 方法重復性

在相同試驗條件下，取10 μL相同批次的N_PMilk樣品，根據步驟1.3.1中所述的樣品制備方法稀釋至1∶100000，進行7次平行試驗，計算7次試驗結果的相對標準偏差，相對偏差小于10%說明重復性較好[15]。

1.3.4 試劑盒交叉反應驗證

分別取10批次O_PMilk、 5批次A2_RMilk及5批次A2_PMilk，使用試劑盒方法進行檢測，以確定A1β-酪蛋白酶聯免疫試劑盒對A2β-酪蛋白是否有交叉反應。

1.3.5 數據處理

試驗數據采用Excel 2010軟件進行計算和統計。四參數曲線采用ELISA Calc軟件進行擬合。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的建立

按照試劑盒使用說明配制12.5～400 ng/mL質量濃度梯度的A1β-酪蛋白溶液標準品并檢測其A450值，得到的吸光度及標準曲線見表1和圖1。由圖1所示，y=（0.92396-0.09188）/[1+（x/95.25601）-0.84058]+ 0.09188，r2=0.99148。A1β-酪蛋白標準曲線r2值超過0.99，曲線表現出良好擬合性。

表1 A1β-酪蛋白標準曲線測定

圖1 A1β-酪蛋白標準曲線

2.2 方法重復性驗證

用A1β-酪蛋白酶聯免疫試劑盒對O_PMilk樣品中A1β-酪蛋白含量進行測定，設置7次平行試驗。對7次測得的數據進行相對偏差計算，以檢測該方法的重復性是否良好，試驗結果見表2。在相同檢測條件下，A1β-酪蛋白酶聯免疫法檢測A1蛋白具有良好重復性，7次重復檢測的相對標準偏差為4.97%（n=7）。SRSD小于10%，表明該方法重復性較好。

表2 樣品重復性檢測結果

2.3 交叉反應驗證

為驗證A1β-酪蛋白酶聯免疫法對牛乳中A2β-酪蛋白是否有交叉反應，分別對多批次O_PMilk、A2_RMilk及A2_PMilk樣品中A1蛋白進行檢測，檢測結果如表3所示。

表3 不同牛奶樣品中A1β-酪蛋白檢測結果

10批次的普通巴氏殺菌乳中由于同時含有A1和A2β-酪蛋白，因此10批次O_PMilk樣品中均可以檢測到不同濃度的A1β-酪蛋白存在，而5批次A2_RMilk和A2_PMilk樣品中均未檢測到A1β-酪蛋白。同時，A2_PMilk樣品經過高分辨質譜方法檢測證明也無A1蛋白存在，說明這與檢測結果十分吻合。因此，試驗結果表明A1β-酪蛋白酶聯免疫法對牛奶中A1β-酪蛋白具有良好的特異性，與A2β-酪蛋白無明顯的交叉反應。

3 結論

A1β-酪蛋白沒有標準檢測方法，報道的研究方法在便利性和經濟成本等方面存在劣勢。研究表明，A1β-酪蛋白酶聯免疫試劑盒法對A1β-酪蛋白的檢測具有良好線性，線性范圍為6.25～400 ng/mL，重復性試驗結果表明相對偏差為4.97%，重復性良好。同時，試劑盒方法對A1β-酪蛋白具有良好的特異性。但是，由于無法獲得商業的A1β-酪蛋白標準品，因此無法對A1β-酪蛋白酶聯免疫試劑盒方法進行定量限和回收率的驗證。同時，由于試劑盒保存期限較短，整個檢測等待時間較長，并且對運輸和測試環境比較敏感，因此該方法仍有待進一步完善。該方法可作為一種檢測手段，用于牛奶中A1β-酪蛋白的定性研究。