歐凱西， 劉 捷， 趙玉民， 張 緣， 周子意， 余成浩△

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 611137；2.西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611137)

風(fēng)熱清口服液由“桔梗湯”和“青黛飲”兩方加熊膽粉組成，縱觀全方具有清熱解毒、宣肺透表、利咽化痰的功能，適用于外感風(fēng)熱所致的發(fā)熱、微惡風(fēng)寒、頭痛、咳嗽、流涕、口渴、咽痛以及急性上呼吸道感染見上述癥狀者[1-2]。已有學(xué)者對風(fēng)熱清口服液的部分藥效學(xué)進(jìn)行了研究及探索，但其鎮(zhèn)痛藥效作用及抗炎鎮(zhèn)痛的作用機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報道。本研究通過小鼠二甲苯耳腫脹試驗(yàn)、小鼠醋酸扭體試驗(yàn)以及小鼠熱板試驗(yàn)探討風(fēng)熱清口服液的抗炎鎮(zhèn)痛藥效作用及其機(jī)制，為風(fēng)熱清口服液臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)參考及依據(jù)。本研究已通過成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查，倫理學(xué)批號2020-13。

1 材料

1.1 動物

SPF級昆明種小鼠150只，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)動物中心，溫度維持在20～25 ℃，濕度維持在40%～70%。

1.2 主要藥品及試劑

風(fēng)熱清口服液(由四川省新鹿藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格：10 mL/瓶，國藥準(zhǔn)字Z10950074)；醋酸地塞米松(由浙江仙琚制藥股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：0.75 mg/片，產(chǎn)品批號：191059)；鹽酸曲馬多緩釋片(Farmaceutici Formenti S.p.A.公司生產(chǎn)，德國格蘭泰有限公司包裝，規(guī)格：0.1 g/片，批號：612R01)；二甲苯(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：20200720；含量≥99.0%)；冰醋酸(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：2020071046；含量≥99.5%)；ELISA試劑盒腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α，依科賽生物科技有限公司，貨號：22J289)；白介素10(interleukin-10,IL-10，貨號：22J295)、白介素4(interleukin-4,IL-4，貨號：22J271)試劑盒均購自依科賽生物科技有限公司；組胺(histamine,HIS，貨號：1W16HYANYC)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PEG2，貨號：6 MQ6Z23HQC)、β-內(nèi)啡肽(β-endorphin,β-EP，貨號：AQK27ESQ2Y)、緩激肽(bradykinin,BK，貨號：SHMCLQPZCH)試劑盒均購自伊萊瑞特生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號：MA0082-2-Jan-09F)。

1.3 主要儀器

電子天平(上海越平科學(xué)儀器制造有限公司FA2004B)；電動勻漿器(天根OSE-Y300)；酶標(biāo)儀(BioTek CYT5MFV)；低溫離心機(jī)(四川蜀科儀器有限公司18091304)；RB-200熱板儀(成都泰盟軟件有限公司)。

1.4 分組及藥液配制

將昆明小鼠隨機(jī)分為5組，模型組、陽性藥對照組(醋酸地塞米松組或鹽酸曲馬多緩釋片組)、風(fēng)熱清口服液低劑量組、風(fēng)熱清口服液中劑量組、風(fēng)熱清口服液高劑量組。醋酸地塞米松組：給藥量為3 mg/kg，實(shí)驗(yàn)用蒸餾水配制成0.3 mg/mL的混懸液備用；鹽酸曲馬多緩釋片組：給藥量為30 mg/kg，實(shí)驗(yàn)用蒸餾水配制成3 mg/mL的混懸液備用；風(fēng)熱清口服液低劑量組：給藥量為5.0125 g/kg，實(shí)驗(yàn)將風(fēng)熱清口服液原液用蒸餾水稀釋4倍備用；風(fēng)熱清口服液中劑量組：給藥量為10.025 g/kg，實(shí)驗(yàn)將風(fēng)熱清口服液原液用蒸餾水稀釋2倍備用；風(fēng)熱清口服液高劑量組：給藥量為20.05 g/kg，實(shí)驗(yàn)用風(fēng)熱清口服液原液。

2 方法

2.1 抗炎試驗(yàn)

觀察風(fēng)熱清口服液對小鼠二甲苯耳廓腫脹的影響。取昆明小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組各10只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，醋酸地塞米松組作為陽性藥對照組，按組分別灌胃蒸餾水、醋酸地塞米松藥液、風(fēng)熱清口服液藥液，給藥體積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，用移液槍取50 μL二甲苯，均勻涂抹于每組小鼠右耳的正反兩面致炎，并觀察昆明小鼠致炎后的狀態(tài)，涂抹二甲苯30 min后處死昆明小鼠，沿耳廓基線分別剪下左耳和右耳，并用打孔器在左右耳同一位置取直徑為8 mm的圓形耳片，用萬分之一電子分析天平稱耳片質(zhì)量，按以下公式計(jì)算小鼠耳腫脹度和腫脹抑制率：腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量。耳腫脹抑制率=(模型組平均耳腫脹度-給藥組平均耳腫脹度)/模型組平均耳腫脹度×100%。

將每組取下的右耳放入EP管中，-80 ℃保存，待之后制備耳組織勻漿提取蛋白，用ELISA法檢測制備的組織勻漿上清液中TNF-α、IL-10、IL-4和組胺含量。

2.2 鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

2.2.1 風(fēng)熱清口服液對小鼠醋酸扭體的影響 取昆明種小鼠50只，雌雄各半，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組各10只，鹽酸曲馬多緩釋片組作為陽性藥對照組，按組分別灌胃蒸餾水、鹽酸曲馬多緩釋片藥液、風(fēng)熱清口服液藥液，給藥體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，在室溫22 ℃環(huán)境下腹腔注射0.6%醋酸10 mL/kg，觀察注射醋酸后的小鼠狀態(tài)，以小鼠后肢及軀干伸長、腹部內(nèi)陷、臀部高起1次定義為1次扭體反應(yīng)，并記錄扭體反應(yīng)的潛伏期以及15 min內(nèi)扭體次數(shù)。用以下公式計(jì)算出扭體抑制率：扭體抑制率=[(模型組扭體平均次數(shù)-給藥組扭體平均次數(shù))/模型組扭體平均次數(shù)]×100%。小鼠扭體反應(yīng)觀察結(jié)束后迅速摘眼球取血，分離血清，-80 ℃保存，ELISA法檢測小鼠血清中PGE2、β-EP、BK的含量。

2.2.2 風(fēng)熱清口服液對小鼠熱板的影響 熱板溫度調(diào)節(jié)至(55±0.5) ℃，將昆明小鼠置于熱板上，分別測定給藥前每只昆明小鼠的正常痛閾值(以小鼠置于熱板上至開始舔舐后足所需要的時間作為痛閾值)，篩選基礎(chǔ)痛閾值在5 s～30 s的雌性昆明小鼠50只，隨機(jī)分為5組各10只。末次給藥后30 min、60 min、90 min、120 min分別測量各小鼠的痛閾值，記錄結(jié)果并進(jìn)行比較。

小鼠觀察結(jié)束后迅速摘眼球取血，分離血清，-80 ℃保存，ELISA法檢測小鼠血清中PGE2、β-EP、BK的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠耳腫脹結(jié)果

表1示，模型組昆明小鼠涂抹二甲苯后均出現(xiàn)煩躁不安、抓撓右耳，可見右耳快速紅腫充血，其充血紅腫情況與左耳比較有明顯差異。風(fēng)熱清口服液低、中劑量組比模型組小鼠耳腫脹程度明顯減輕(P<0.05)。

表1 風(fēng)熱清口服液對二甲苯致炎小鼠耳腫脹的影響

3.2 各組小鼠耳組織中炎癥因子含量結(jié)果

表2示，風(fēng)熱清口服液低劑量組與模型組比較，可減少小鼠耳組織中TNF-α、組胺含量(P<0.05)，并提高IL-4含量(P<0.01)；風(fēng)熱清口服液中劑量組與模型組比較，可減少小鼠耳組織中組胺含量(P<0.05)，提高IL-4含量(P<0.05)，風(fēng)熱清口服液各組與模型組比較，耳組織中IL-10的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 風(fēng)熱清口服液對二甲苯致炎小鼠耳組織中TNF-α、IL-10、IL-4、組胺的影響

3.3 各組小鼠醋酸扭體試驗(yàn)結(jié)果

表3示，腹腔注射0.6%醋酸后模型組小鼠扭體陽性率為100%，出現(xiàn)典型的扭體動作軀干和后肢因刺激而伸長、腹腔凹陷、臀部高起。風(fēng)熱清口服液低、中、高劑量組扭體潛伏期與模型組比較扭體潛伏期有一定的延長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。風(fēng)熱清口服液低劑量組與模型組比較可減少小鼠扭體次數(shù)(P<0.05)，且低劑量組扭體抑制率達(dá)到49.02%。

表3 風(fēng)熱清口服液對小鼠醋酸扭體的影響

3.4 各組小鼠血清PGE2、β-EP、BK含量結(jié)果

表4示，風(fēng)熱清口服液低劑量能降低醋酸扭體小鼠血清中的PGE2含量(P<0.05)；風(fēng)熱清口服液低、中、高劑量能提高醋酸扭體小鼠血清中的β-EP含量(P<0.05)；風(fēng)熱清口服液低、中、高劑量組中檢測到BK含量與模型組比較雖有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 風(fēng)熱清口服液對扭體小鼠血清PGE2、β-EP、BK含量的影響

3.5 各組小鼠熱板試驗(yàn)結(jié)果

表5示，將昆明小鼠置于溫度調(diào)節(jié)至(55±0.5) ℃的熱板上，小鼠因疼痛而出現(xiàn)舔后足的表現(xiàn)。各組之間給藥前的基礎(chǔ)痛閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。風(fēng)熱清口服液中、高劑量能延長小鼠給藥30 min后的痛閾值(P<0.05)；風(fēng)熱清高劑量能延長小鼠給藥60 min后的痛閾值(P<0.01)。

表5 風(fēng)熱清口服液對熱板小鼠的影響

3.6 各組小鼠血清PGE2、β-EP、BK含量結(jié)果

表6示，風(fēng)熱清口服液高劑量能降低熱板小鼠血清中PGE2含量(P<0.05)；風(fēng)熱清口服液中、高劑量能降低熱板小鼠血清中BK含量(P<0.01)，并提高熱板小鼠血清中β-EP含量(P<0.01)。

表6 風(fēng)熱清口服液對熱板小鼠血清PGE2、β-EP、BK含量的影響

4 討論

風(fēng)熱清口服液主要由山銀花、青黛、熊膽粉、瓜蔞皮、桔梗、甘草組成。山銀花、桔梗可疏散風(fēng)熱，清利咽喉，熊膽粉、青黛清熱解毒，瓜蔞皮生津養(yǎng)陰，全方配伍精當(dāng)，可運(yùn)用于外感風(fēng)熱證。小鼠二甲苯耳腫脹模型是經(jīng)典的抗炎模型，二甲苯可在涂抹局部誘導(dǎo)組胺、激肽等炎癥介質(zhì)釋放，進(jìn)而導(dǎo)致局部毛細(xì)血管通透性增加和炎癥細(xì)胞浸潤[3]。其中最關(guān)鍵的促炎因子則是TNF-α，該因子能夠促進(jìn)上皮、淋巴細(xì)胞產(chǎn)生多種黏附分子，并誘導(dǎo)趨化因子的生成，從而介導(dǎo)炎性細(xì)胞向炎癥局部聚集，最終造成組織損傷、炎癥等病理變化[4]。而當(dāng)機(jī)體遭受炎癥刺激時，不僅會分泌促炎因子，也會產(chǎn)生大量抗炎因子，其中IL-4、IL-10是單核巨噬細(xì)胞分泌促炎因子的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子[5，6]，可以抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，限制組織損傷[7]。本研究表明，風(fēng)熱清口服液低、中劑量對二甲苯耳腫脹模型有抑制作用，提示風(fēng)熱清口服液具有抗炎作用。對其作用機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)熱清口服液低劑量組能抑制耳組織中致炎因子TNF-α的含量，且低劑量和中劑量組能抑制耳組織中組胺的含量，同時提高抗炎因子IL-4的含量，說明風(fēng)熱清口服液不僅能降低促炎因子，還能促進(jìn)抗炎因子的分泌，通過正負(fù)反饋雙向調(diào)節(jié)達(dá)到抑制炎癥作用。

小鼠熱板試驗(yàn)與醋酸扭體試驗(yàn)是熱刺激和化學(xué)刺激的致痛模型。在鎮(zhèn)痛研究中，PGE2是重要指標(biāo)，許多實(shí)驗(yàn)都表明在外周和中樞組織中PGE2具有誘導(dǎo)疼痛的作用。Ferreira等[8]通過對大鼠皮下注射PGE2，可導(dǎo)致大鼠痛覺過敏。β-EP是一種內(nèi)源性阿片肽，具有調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、免疫機(jī)能和中樞鎮(zhèn)痛等功能，它可通過減少神經(jīng)元P物質(zhì)釋放，抑制傷害性感受器興奮，達(dá)到抑制痛覺傳導(dǎo)的作用[9]。BK在調(diào)節(jié)疼痛感覺的有關(guān)離子通道表達(dá)方面起關(guān)鍵作用，是公認(rèn)的致痛物質(zhì)[10]。本研究表明，風(fēng)熱清口服液低劑量能抑制醋酸扭體小鼠的扭體次數(shù)，且風(fēng)熱清口服液低中高劑量均能提高醋酸扭體小鼠血清中鎮(zhèn)痛物質(zhì)β-EP的含量，風(fēng)熱清口服液低劑量組還能抑制致痛物質(zhì)PGE2的含量。在小鼠熱板試驗(yàn)中，風(fēng)熱清中劑量在給藥30 min后對小鼠熱板疼痛反應(yīng)具有抑制作用，風(fēng)熱清高劑量在給藥30、60 min對小鼠熱板疼痛反應(yīng)具有抑制作用。風(fēng)熱清口服液高劑量能抑制熱板小鼠血清中PGE2、BK含量，并提高β-EP含量；風(fēng)熱清口服液中劑量能減少BK含量，提高β-EP含量，說明風(fēng)熱清口服液對熱刺激及化學(xué)刺激的致痛模型均具有一定的鎮(zhèn)痛作用。并在機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，風(fēng)熱清口服液能通過減少致痛物質(zhì)、提高鎮(zhèn)痛物質(zhì)，共同達(dá)到鎮(zhèn)痛作用。

綜上所述，風(fēng)熱清口服液具有抗炎鎮(zhèn)痛作用，其抗炎作用機(jī)制可能與抑制耳組織中促炎因子TNF-α、組胺和增強(qiáng)抗炎因子IL-4的含量有關(guān)，鎮(zhèn)痛作用機(jī)制可能與抑制血清中的致痛物質(zhì)PGE2、BK含量和促進(jìn)鎮(zhèn)痛物質(zhì)β-EP的釋放有關(guān)。