凌 佳， 柳 卓， 劉 檢， 朱 青， 韓遠山， 趙洪慶， 孟 盼， 楊 蕙， 王宇紅△

(1.湖南中醫藥大學科技創新中心， 長沙 410208；2.湖南省中醫研究院附屬醫院， 長沙 410006；3.湖南中醫藥大學第一附屬醫院， 長沙 410007；4.中南大學湘雅醫學院附屬腫瘤醫院， 長沙 410007)

糖尿病并發抑郁癥(diabetes mellitus with depression,DD)是糖尿病患者常見的以認知功能障礙為主要特征表現的慢性并發癥。據報道，60%～75%糖尿病患者有抑郁情緒[1]，且DD患者的死亡率明顯高于單純糖尿病患者[2]，因此開展DD的發病機制及防治應用研究很有意義。神經血管單元(neurovascular unit，NVU)主要包含微血管、周圍星形膠質細胞及其突起的周圍神經元等部分[3-4]。前期研究發現，DD大鼠血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)相關蛋白表達下降，提示BBB損傷[5]，在此基礎上推測NVU結構也可能受損。膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、間隙連接蛋白-43(connexin-43, CX43)和緊密連接蛋白(occluding)分別是星形膠質細胞的骨架蛋白，星形膠質細胞與神經元之間、星形膠質細胞與微血管內皮細胞之間的連接通道。故本研究建立神經元(neuron,NE)、星形膠質細胞(Astroglia，AS)、腦微血管內皮細胞(The brain microvascular endothelial cells,BMECs)三細胞體外共培養體系，采用高糖聯合皮質酮模擬DD環境，擬從NVU角度探討左歸降糖解郁方對模擬DD環境下GFAP、CX43及occluding的影響，并初步探討中藥復方對DD大鼠海馬NVU的保護作用。

1 材料

1.1 藥物

左歸降糖解郁方(以下簡稱左歸方)組成：黃芪、牛膝、山茱萸、枸杞子、丹參、熟地黃、菟絲子、姜黃、杜仲、牡丹皮、貫葉金絲桃，購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，并按比例水煎濃縮后制成口服液。鹽酸二甲雙胍片(吉林省東北亞藥業股份有限公司，國藥準字H22020508，0.25 g/片)；鹽酸氟西汀(西南藥業股份有限公司，國藥準字J20160029，20 mg/片)。

1.2 動物

SPF級SD大鼠，其中新生1 d和10 d的乳鼠各5只，雌性成年大鼠(受孕18 d)3只(400～450 g)，9只雄性成年大鼠(200～220 g)，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號SCXK(湘)2015-0003。AS原代取材于1 d新生乳鼠中。BMECs原代取材于10 d新生乳鼠，海馬NE原代取材于受孕雌性大鼠。雄性實驗大鼠飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院SPF級實驗動物中心，適應性飼養5 d，溫度(25±5)℃，濕度40%。

1.3 試劑

皮質酮(Sigma，貨號CCAD300161)、L-多聚賴氨酸(Sigma，貨號25988-63-0)、DMSO(Sigma，貨號67-68-5)；Ⅰ型膠原酶(Amresco，貨號C0130)，兔抗大鼠神經元特異性烯醇化酶(nerve-specific enolase，NSE)多克隆抗體(Bioworld，貨號6813-50)；兔抗大鼠GFAP抗體、DAPI(Abcam，貨號ab218309、ab104139)；兔抗大鼠occluding抗體(Proteintech，貨號13409-1-AP)、兔抗大鼠CX43抗體(Proteintech，貨號15386-1-AP)、小鼠抗大鼠GAPDH抗體(Proteintech，貨號10494-1-AP)。

1.4 儀器

ABI3500型高內涵成像分析系統(PerkinElmer)；3422，3412，3450，3460型Transwell小室(Corning)；Galaxy 48 R型三氣細胞培養箱(Eppendorf)；GR-60DA/GR型高壓蒸汽滅菌鍋(Zealway)；6406型體視顯微鏡(Leica)。

2 方法

2.1 海馬NVU模型的建立

2.1.1 NE、As及BMECs原代培養及鑒定

(1)NE原代培養及鑒定：10 %水合氯醛腹腔麻醉18 d 受孕SD大鼠，取胎鼠全腦中海馬，剪碎后加0.25%胰蛋白酶和0.2%膠原酶(1：1)混合液消化、離心、重懸、過篩、計數，6 × 104/孔接種于96孔培養板(預包被)，4 h后全量換成維持液(Neurobassal：B27補充劑：Glutamax：雙抗=96∶2：1∶1)，第3天半量更換維持液。待NE生長5 d后，室溫固定30 min，0.25% TritonX-100孵育，30 min封閉(5% BSA)，滴加兔抗大鼠NSE，4 ℃過夜；加FITC標記的二抗37 ℃孵育1 h，加DAPI室溫20 min，50 μL PBS，Operetta型高內涵成像分析(high content analysis，HCA)系統觀察、拍照并分析。

(2)As原代培養及鑒定：將新生3 d乳鼠脫臼處死后無菌取出大腦，去血管和腦膜保留皮質，剪碎、消化、離心、重懸、過篩、計數，5×105/瓶接種至預包被的25 cm2培養瓶中，30 min后轉移上清培養液至另一培養瓶中繼續培養。每3 d換液1次，振蕩棄除脫落細胞，正常培養基繼續培養即可。培養2代后將細胞混懸液接種到96孔培養板中(5×105/mL)，待細胞生長基本融合后，根據上述操作，以GFAP抗體和DAPI作為標記，采用HCA系統觀察分析。

(3)BMECs：原代培養及鑒定：根據上法取出新生10 d乳鼠大腦皮質，離心后棄上清；在沉淀的組織中等量加入25% 牛血清白蛋白后反復吹懸，離心2次，將所得血管沉淀按1∶2比例加入0.1% Ⅱ型膠原酶，消化、重懸后離心，再次重懸后按1×104/mL密度接種至預包被培養瓶中備用。將培養至第2代、密度為1×105/mL的細胞混懸液接種到24孔培養板中，待生長基本融合后，根據以上操作，以PECAM-1/CD31和DAPI作為染色劑，采用HCA系統觀察分析。

2.1.2 海馬NVU體外培養體系的構建 將原代海馬NE接種于6孔培養板內；將AS純化、消化、重懸，于Transwell小室外側接種1×105細胞懸液，繼續培養1 d；接種1×105個BMECs細胞純化、消化、重懸，并向小室內側培養1 d后，將接種有AS和BMECs的小室轉移到接種有NE的6孔板內，即得NVU體外共培養體系[6]。

2.2 含藥血清的制備

SD大鼠隨機分為左歸方含藥血清組、陽性藥含藥血清組、空白血清組，每日分別對應給予臨床有效3倍量的左歸方(32.8 g/kg)、氟西汀+二甲雙胍(1.8 mg/kg，0.18 g/kg)、蒸餾水[7]，連續3 d(每日2次)灌胃給藥，末次給藥后取血靜置2 h后離心，小心吸取上清，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾膜過濾，分裝后低溫保存備用。

2.3 模擬DD環境的構建及分組、藥物干預

待NVU共培養體系構建3 d后，給予高糖(150 mmol/L)聯合皮質酮(200 μmol/L)進行干預18 h[8]，構建模擬DD狀態下NVU模型。隨機分為空白血清對照組、正常對照組、模型組、左歸方含藥血清組、陽性藥含藥血清組，依次加入10%的空白血清、陽性藥(氟西汀+二甲雙胍)含藥血清及左歸方含藥血清，同時向模型組與正常組中分別加入等量培養液以補齊液面。

2.4 海馬NVU屏障功能的測定

2.4.1 跨內皮細胞電阻值(trans-epithelial electrical resistance,TEER)檢測 在共培養Transwell小室內外側的AS和BMECs分別基本融合為單層時，根據儀器說明書采用Millipore ERS-2電阻儀測量TEER。

2.4.2 NVU體系滲透性檢測 待細胞共培養基本融合為單層時(3 d左右)，加培養液保證Transwell小室內外側液面高度差為0.5 cm，將共培養體系置于培養箱中正常培養4 h，觀察并測量Transwell小室內外側液面高度變化情況。

2.5 Western blot檢測海馬NVU結構蛋白的表達

干預18 h后去除體系所有培養液，PBS清洗后分別裂解并收集AS、BMECs細胞，冰上裂解60 min，離心取上清得到蛋白提取液定量備用。根據目的蛋白分子量選擇對應濃度的分離膠，上樣、電泳，加入一抗(GFAP、CX43、Occluding)稀釋液(1∶1000) 4 ℃孵育過夜，二抗緩沖液(1: 1000)室溫孵育1 h顯影。應用ImageJ軟件對條帶進行分析，并得到相應灰度值。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 海馬NVU各細胞形態及鑒定結果

圖1示，倒置相差顯微鏡下，對單獨培養的BMECs、AS和NE進行形態學觀察。可見BMECs胞體紡錘形，呈鋪路石樣簇狀生長；AS多呈卵圓形或圓形，胞體凸起較多較長，胞體圓潤光滑，折光性好；NE縱橫交錯形成神經元網絡，折光性較好。采用HCA系統檢測發現，3種細胞分別經特異性標志物染色后，可見綠色熒光在胞漿中呈陽性表達，隨機選取10個視野，結果表明陽性細胞率均達95%以上。

注：A1.BMECs第二代培養5 d；A2.BMECs熒光鑒定；B1.AS第二代培養5 d；B2.GFAP熒光鑒定；C1.NE原代培養5 d；C2.NE熒光鑒定；神經元(neuron,NE)、星形膠質細胞(astroglia,AS)、腦微血管內皮細胞(The brain microvascular endothelial cells,BMECs)、膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)

3.2 左歸降糖解郁方對模擬DD環境下海馬NVU屏障功能的影響

圖2示，與正常對照組比較，模型組TEER值顯著降低(P<0.05)。與模型組比較，陽性藥含藥血清組和左歸方含藥血清組TEER值均顯著升高(P<0.05)，提示左歸方對模擬DD環境下海馬NVU體外模型屏障功能有一定的保護作用。

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05；正常對照組(Control Group)；空白血清對照組(Vehicle Group)；模型組(Model Group)；陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組(Postive Group)；左歸方含藥血清組(Test Group)

圖3示，與正常對照組比較，模型組4 h滲漏試驗液面差值顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，陽性藥含藥血清組和左歸方含藥血清組4 h滲漏試驗液面差值均顯著降低(P<0.05)，同樣表明左歸方對模擬DD環境下海馬NVU體外模型屏障功能具有一定保護作用。

注：與正常組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05；正常對照組(Control Group)；空白血清對照組(Vehicle Group)；模型組(Model Group)；陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組(Postive Group)；左歸方含藥血清組(Test Group)

3.3 左歸方對模擬DD環境下海馬NVU結構蛋白表達的影響

圖4示，與正常對照組比較，AS細胞GFAP、CX43積分光密度值均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性藥含藥血清組和左歸方含藥血清組AS細胞GFAP、CX43積分光密度值均顯著升高(P<0.05)，提示在模擬DD環境下海馬NVU體外模型中，左歸方能上調GFAP、CX43蛋白的表達。

注：與正常對照組比較：*P<0.05，與模型組比較：#P<0.05；A.正常對照組(Control Group)；B.空白血清對照組(Vehicle Group)；C.模型組(Model Group)；D.陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組(Postive Group)；E.左歸方含藥血清組(Test Group)；膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)，間隙連接蛋白(Connexin43,Cx43)

圖5示，與正常對照組比較，模型組BMECs細胞occluding積分光密度值均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性藥含藥血清組和左歸方含藥血清組BMECs細胞occluding積分光密度值均顯著升高(P<0.05)，提示左歸方能逆轉模擬DD環境下海馬NVU體外模型中occluding的蛋白表達。

注：與正常對照組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05；A.正常對照組(Control Group)；B.空白血清對照組(Vehicle Group)；C.模型組(Model Group)；D.陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)含藥血清組(Postive Group)；E.左歸方含藥血清組(Test Group)；occluding為緊密連接蛋白

4 討論

左歸方由經方左歸丸化裁而來，去龜甲膠、鹿角膠、山藥3味大補陰之品，新增貫葉連翹以疏肝解郁，加丹參、牡丹皮以活血祛瘀，添黃芪以補氣健脾，再輔以杜仲以增牛膝之補肝腎之功。

NVU涵蓋神經元和BBB 2個部分，并重點強調神經元、神經膠質細胞及腦微血管之間的相互作用[9]，故可從整體角度闡述神經系統相關疾病的發病機制與治療機制。TEER和4 h滲漏試驗均是檢測BBB通透性的經典方法，其中TEER測量反映生物屏障對帶電離子對的通透性，是檢測血腦屏障通透性最敏感的指標之一[10]。而4 h滲漏試驗則可直接反映血腦屏障的完整性。從本實驗結果可知，經左歸方含藥血清處理后，模擬DD環境下NVU模型中的TEER值提高，表明該方對模擬DD環境下NVU模型的屏障結構具有一定保護作用。AS骨架蛋白GFAP的表達反映AS的功能狀態。CX-43主要存在于AS和NE，是成年哺乳類動物中樞神經系統中表達最強的縫隙連接蛋白[11]。有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)可通過控制CX43等磷酸化過程而保持半通道關閉狀態[12]。occluding是BMECs與AS之間的中間橋梁蛋白，具有柵欄功能和屏障調節功能[13]。本實驗結果表明，DD組GFAP、CX-43和occluding 3種結構蛋白表達均有下降，提示BMECs與AS之間、AS與NE之間的連接均受到損傷，同時AS的數目也呈下降趨勢。而陽性藥(二甲雙胍+氟西汀)和左歸方均可恢復連接蛋白的表達，提示左歸方對模擬DD環境下NVU模型具有保護作用，且可能是通過影響GFAP、CX-43以及occluding的表達，保護NVU各環節之間的連接功能而發揮的。

綜上所述，左歸方可通過上調GFAP、CX43和occluding蛋白表達，維持海馬NVU的完整性，實現對DD狀態下海馬NVU的修復作用。本研究結果證明了NVU可作為研究DD的一個靶點，但其具體的信號通路及傳導過程還需做進一步的深入研究。