七氟醚吸入對糖尿病模型大鼠空間學習和記憶能力的影響及其機制

倫明輝，杜薇，蔡哲，黃澤清

遼寧省腫瘤醫院中國醫科大學腫瘤醫院麻醉科，沈陽110042

術后認知功能障礙（POCD）是圍術期的嚴重并發癥，可導致患者康復延遲、醫療費用增加，甚至病死率增高等，但其發生原因復雜［1］。糖尿病是POCD的第二大誘發因素［2］，糖尿病控制不佳也可致患者輕度認知功能損害（MCI），臨床癥狀以學習和記憶能力下降為主［3］。七氟醚是目前臨床上常用的吸入性麻醉藥。多年來人們一直認為麻醉藥的效應隨其藥理作用消退而消失，一旦藥物消除，靶器官將恢復到以前的狀態，但越來越多的證據表明并非如此。最新研究［4］發現，TNF-α 具有調節炎癥反應與大腦功能的作用，過多的TNF-α 表達可致認知功能發生衰退。還有研究［5］發現，老年大鼠腹部切開縫合術后海馬組織中IL-1β mRNA 水平明顯增加，且在迷宮實驗中表現出認知功能的靈活性受到影響。七氟醚對糖尿病模型大鼠的空間學習和記憶能力有何影響目前尚無定論。2020年5月-2020年11月，本研究觀察了七氟醚吸入對糖尿病模型大鼠空間學習和記憶能力的影響，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 SPF 級雄性成年SD大鼠72 只，體質量200～260 g，由遼寧省實驗動物資源中心（遼寧長生生物技術有限公司）提供，合格證號：NO. 211002300003081。大鼠適應性飼養一周，維持室溫22～25 ℃，相對濕度65%～70%，自然晝夜光線，供給充足的飼料和水。七氟醚購自日本丸石制藥株式會社（批號2222），鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma 公司。Accu-chek Active 血糖儀及試紙購自Roche Diagnostics GmbH 公司，Datex Ohmeda 7100型麻醉機及Datex Ohmeda S/5 監護儀購自芬蘭Hel?sinki 公 司，PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒購自TaKaRa 公司，Brilliant ⅢUltra-Fast SYBR Green QPCR Master Mix 試劑 盒 購自Agi?lent Technologies公司。

1.2 糖尿病模型大鼠的制備、分組及七氟醚吸入方法 48只SD大鼠給予腹腔內注射STZ 53 mg/kg，注射后恢復正常進食飲水，72 h后取靜脈血檢測血糖，血糖≥16.7 mmol/L 判定為糖尿病模型大鼠造模成功［6］。將糖尿病模型大鼠隨機分為2組，即模型組和七氟醚組，每組24只。另24只正常SD大鼠，記為空白對照組。參照CULLEY 等［7］的方法對七氟醚組大鼠進行3.4%七氟醚吸入麻醉干預3 h。模型組及空白對照組大鼠同期吸入30%氧氣3 h。

1.3 各組大鼠不同時間點空間學習和記憶能力評估 七氟醚吸入后第1 天和第3 天，每組隨機抽取12 只大鼠，采用Morris 水迷宮實驗［8］評估大鼠空間學習和記憶能力，包括定位航行實驗、反轉空間探索實驗。①定位航行實驗。所有大鼠在實驗前6 d 行Morris 水迷宮定位航行訓練，實驗訓練過程中保持平臺位置不變。將大鼠由平臺所在象限的對側放入水池，每次實驗以120 s 為限，記錄動物從入水點到達平臺所需時間。訓練中若動物在120 s 內找到平臺，讓其在平臺上停留20 s；若動物未能找到平臺，計算機停止跟蹤，記錄時間為120 s，將其放在平臺上使其停留20 s。每日上午、下午固定時間各訓練一次，重復上述實驗，持續6 d。七氟醚吸入后第1天和第3天，記錄各組大鼠尋找到平臺時間，即為逃避潛伏期。②反轉空間探索實驗。定位航行實驗結束后行反轉空間探索實驗，即將平臺放在對側的象限，記錄大鼠入水后穿越原平臺位置次數及找到遷移后平臺潛伏期。Morris 水迷宮實驗結束后立即斷頭處死大鼠，分離取出海馬組織后立即放入液氮中冷卻，存于-80 ℃冰箱內。

1.4 各組大鼠不同時間點海馬組織中促炎因子IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 檢測 采用熒光定量PCR 法。取各組冷凍保存的海馬組織50 mg 放入研缽中，加入液氮迅速研磨，重復3 次；加入1 mL TRIzol 移入離心管中，室溫放置5 min；4 ℃條件下12 000×g離心10 min，取上清，加入200μL 氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置5 min，4 ℃條件下12 000×g離心15 min。取無色上層水相400μL，加入500μL 異丙醇，顛倒10 次混勻，室溫放置10 min 使RNA 沉淀形成，4 ℃條件下12 000×g離心10 min，棄上清，加入1 mL 75%乙醇，吹打洗滌沉淀，4 ℃條件下7 500×g離心5 min，棄上清，空氣干燥至乙醇全部揮發；加入無RNA 酶水30μL 溶解RNA，核酸蛋白分析儀測定RNA 濃度。取4 μL RNA 樣品稀釋25 倍，轉移至比色杯中，使用核酸蛋白分析儀檢測吸光度，記錄OD260和OD260/OD280值，計算RNA 濃度。使用Prime?Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒進行反轉錄，使用Stratagene Mx3000p熒光定量PCR 儀進行PCR 反應。使用Primer-BLAST 設計引物：IL-1β上游引物為5′-CAGCTTTCGACAGTGAGGAGA-3′，下 游 引 物 為5′-TGTCGAGATGCTGCTGTGAG-3′；TNF-α 上游引物為5′-ATGGGCTCCCTCTCATCAGT-3′，下 游 引 物 為5′-GCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3′；以β-actin 為內參，其上游引物為5′-CGCGAG?TACAACCTTCTTGC-3′，下游引物為5′-CGTCATC?CATGGCGAACTGG-3′。以2-ΔΔCt表 示 海 馬 組 織 中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。計量資料以±s表示，比較用單因素方差分析及LSD 多重檢驗法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 吸入七氟醚后不同時間點各組大鼠空間學習和記憶能力比較 吸入七氟醚后不同時間點各組大鼠空間學習和記憶能力比較見表1。由表1可知，與空白對照組、模型組和同組內第3天相比，七氟醚組大鼠吸入七氟醚后第1天的空間學習和記憶能力均降低（P均<0.05）。

表1 吸入七氟醚后不同時間點各組大鼠空間學習和記憶能力比較（x±s）

2.2 吸入七氟醚后不同時間點各組大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相對表達量比較 吸入七氟醚后不同時間點各組大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相對表達量比較見表2。由表2可知，與空白對照組相比，模型組和七氟醚組大鼠海馬組織中吸入七氟醚后第1 天、第3 天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 均升高（P均<0.05）；與模型組相比，七氟醚組大鼠海馬組織中吸入七氟醚后第1天、第3天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 均升高（P均<0.05）；與同組內第3天相比，七氟醚組大鼠海馬組織中吸入七氟醚后第1 天IL-1β mRNA、TNF-α mRNA均升高（P均<0.05）。

表2 吸入七氟醚后不同時間點各組大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA相對表達量比較（x±s）

3 討論

POCD 是一種病因復雜的圍術期嚴重并發癥。目前臨床研究［9］已經證實，老齡是非心臟手術術后長期POCD 的惟一獨立危險因素。但除了老齡外，合并糖尿病患者可能因體內自身代謝紊亂，在外源性應激下更容易對大腦造成損害［10］。而且糖尿病是目前臨床上常見的慢性病之一，其發病率呈逐年上升的趨勢，已達到了流行病的程度。臨床上糖尿病患者可能由于存在胰島素抵抗，而使胰島素的促進神經細胞突觸形成、增大胞體面積的作用減弱，進而易致患者認知功能受損，對外來刺激更加敏感。隨著對糖尿病的研究深入，越來越多的研究［11］表明，炎癥在糖尿病的發生發展過程中起著不可低估的致病作用，而且有研究發現炎癥反應和胰島素抵抗有著緊密的聯系。

不同研究者采用腹腔注射STZ 液50～60 mg/kg誘導建立糖尿病模型大鼠。本研究應用腹腔注射STZ 液53 mg/kg，誘導72 h 后取尾靜脈血，檢測血糖均超過16.7 mmol/L，說明糖尿病模型大鼠造模成功。造模成功后約3 d 大鼠開始出現明顯多飲、多食、多尿癥狀；隨著高血糖持續，大鼠隨之逐漸出現毛色干枯發黃、精神萎靡等，其一般生理特征與臨床糖尿病患者癥狀和體征相似，符合糖尿病病理生理特征。有研究［12］顯示，腹腔注射STZ液55 mg/kg，造模成功后給予充足飼料和水飼養65 d后可形成糖尿病腦病模型，大鼠行為學測試學習和記憶能力顯著下降，解剖分離海馬組織并鏡下觀察到海馬組織CA1區神經元細胞大量死亡。本實驗基于此文獻及預實驗研究結果選擇STZ液誘導糖尿病造模成功后普通飼料飼養大鼠2 周后給予吸入麻醉干預，進而評價大鼠獲取空間學習和記憶能力。本實驗結果顯示，模型組大鼠Morris水迷宮測試逃避潛伏期、反轉空間探索實驗穿越原平臺位置次數及找到遷移后平臺潛伏期與空白對照組比較無統計學差異，說明STZ 誘導糖尿病大鼠2 周這單一處理因素并沒有影響其空間學習和記憶能力。七氟醚組吸入干預后第1 天大鼠的水迷宮定位航行測試逃避潛伏期與空白對照組比較延長，反轉空間探索測試穿越原平臺次數減少，表明糖尿病模型大鼠行七氟醚吸入麻醉干預后第1 天其獲取空間學習能力受到影響；七氟醚組吸入干預后第1天大鼠的反轉空間探索測試尋找到遷移后平臺潛伏期與空白對照組比較延長，表明大鼠其獲取空間的再學習能力也受到影響。本研究還發現，七氟醚組吸入干預后第3 天大鼠的各項水迷宮測試成績與空白對照組比較無明顯差異，表明吸入麻醉干預后第3天大鼠空間學習記憶能力無明顯改變。

POCD 發病機制不明，近年來許多基礎研究發現可能與乙酰膽堿含量減少、S100β 蛋白表達增高、tau 蛋白過度磷酸化、β 淀粉樣蛋白沉積增加或中樞炎癥反應相關。中樞系統促炎因子TNF-α、IL-1β 協同作用下啟動炎性級聯反應，誘導中性粒細胞不斷聚集，最終導致組織器官損傷。BARRIENTOS 等［13］研究也發現，對老齡大鼠腦室內注射IL-1 受體拮抗劑能夠有效預防老齡大鼠POCD 和神經炎癥的發生。有動物實驗研究［14］顯示，鞘外注射LPS 激活外周免疫系統能夠引起中樞神經系統炎癥如IL-1、IL-6 和TNF-α 等促炎因子的增高，后者可能通過直接（外周促炎因子通過激活的轉運機制直接滲透過血腦屏障）或間接（促炎因子通過刺激迷走神經）的機制而影響認知功能。本實驗結果顯示，模型組、七氟醚組大鼠促炎因子IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 的相對表達量較空白對照組均增加。但在七氟醚吸入干預后第3 天其mRNA 表達呈下降趨勢，但仍高于空白對照組水平。IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 表達趨勢與各組大鼠Morris 水迷宮測試成績趨勢相一致。各組大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA 相對于空白對照組表達量均有增加且七氟醚組吸入干預后第1 天增加量最多，但Morris 水迷宮測試成績只有七氟醚組吸入干預后第1 天有統計學差異，據此推測中樞神經系統內IL-1β mRNA、TNF-α mRNA表達升高只有達到一定程度可能才表現出行為學的改變。

綜上所述，七氟醚吸入可致糖尿病模型大鼠出現早期空間學習和記憶能力下降，但這種影響是可逆的，其機制可能與大鼠海馬組織中IL-1β mRNA、TNF-α mRNA的表達升高有關。