尾靜脈注射miR-10a過表達慢病毒后動脈粥樣硬化小鼠頭臂干動脈內皮損傷情況、硬化斑塊面積觀察

崔佳，李菲，張明明，馬倩，路永剛，帖彥清

1 河北省人民醫院檢驗科，石家莊050051；2 河北醫科大學第一醫院保健處

動脈粥樣硬化是心腦血管發病的病理學基礎，是由多種免疫細胞及其產生的抗體［1］、血小板異常激活［2］、內皮細胞損傷［3］、炎性細胞因子［4］等共同參與的慢性炎癥性疾病。在各種病理因素如炎癥、創傷及自身免疫性疾病等的刺激下，可引起內皮細胞損傷、血小板異常激活，使內皮細胞及血小板表面的磷脂類物質充分暴露，此時存在于血液中的β2糖蛋白I（β2GPI）與其表面的抗磷脂抗體（APL）相結合形成復合物［5］，進而引起PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活［6-7］，引起血管內皮細胞增殖、內膜增生及血管的病變，最終引起動脈粥樣硬化的形成［8］。微小RNA（miRNA）是一類有19～24 個核苷酸的小分子RNA，miRNA-10a 作為miRNA 中的重要類型，參與炎癥、免疫應答反應等多種生物學過程［9］。目前，已經證實miR-10a與多個癌種如結直腸癌［10］、彌漫大B細胞淋巴瘤［11］等存在著密切的關系。既往研究［12］表明，動脈粥樣硬化組織的內皮細胞中miR-10a 通過下調炎癥分子進而抑制動脈粥樣硬化的形成或進展。2019年12月—2020年9月，本研究觀察了尾靜脈注射miR-10a 過表達慢病毒后動脈粥樣硬化小鼠頭臂干動脈內皮損傷情況、硬化斑塊面積變化，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 動物、過表達miR-10a慢病毒及試劑 10只雄性apoE-/-小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，過表達miR-10a 慢病毒購自北京合生基因科技有限公司。磷酸化-PI3K、磷酸化-AKT 及磷酸化mTOR 均購自CST 公司，冷凍高速離心機購自賽默飛世爾科技有限公司，正置顯微鏡購自Carl Zeiss公司，石蠟切片機購自Leica 公司，體視解剖顯微鏡購自Leica 公司，Western 用電泳儀、電轉移槽及電源均購自北京六一生物科技有限公司，全自動凝膠成像系統購自Syngene 公司，全自動熒光PCR 分析儀購自羅氏公司。

1.2 動物分組、動脈粥樣硬化模型制作及過表達miR-10a 慢病毒給予方法 6 周雄性apoE-/-小鼠共10 只，體質量（21 ± 2）g，飼養于河北省人民醫院SPF 級環境中，室溫保持在（21.0 ± 0.2）℃，用含1.25%高膽固醇飼料喂食4 周，建立小鼠動脈粥樣硬化模型。將成功建立動脈粥樣硬化模型的小鼠隨機分為模型組和miR-10a 組，每組5 只。miR-10a 組小鼠尾靜脈注射100 μL 1×108PFU/mL 的miR-10a慢病毒，模型組小鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。兩組小鼠繼續飼養3 周后處死，取頭臂干動脈粥樣硬化血管組織用于實驗。

1.3 兩組小鼠頭臂干動脈內皮損傷情況觀察 取頭臂干動脈粥樣硬化血管組織，使用2.5%的戊二醛混合固定液固定、脫水、滲透、包埋后，半薄切片，用甲苯氨藍染色觀察，光鏡定位選取所需要的部位，超薄切片（500 A），醋酸鈉、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察小鼠內皮損傷情況。

1.4 兩組小鼠頭臂干動脈中動脈粥樣硬化斑塊面積測算 采用改良Masson 三色染色法。取頭臂干動脈粥樣硬化血管組織，使用2.5%的戊二醛混合固定液固定、脫水、滲透、包埋后，半薄切片，固定于Bouin液媒染，沖洗干凈，天青石藍滴染，Mayer蘇木素染3 min，酸性乙醇分化，然后用麗春紅品紅滴染，用磷鉬酸溶液處理，苯胺藍染色5 min后弱酸處理2 min，乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，于普通光鏡下觀察染色情況，并測算動脈粥樣硬化斑塊面積。

1.5 兩組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內miR-10a檢測 采用Q-PCR法。使用TRIzol試劑提取頭臂干動脈粥樣硬化血管組織的總RNA，按照miR?cute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cD?NA，在冰上配置PCR 反應體系后放入PCR 儀進行PCR 反應。引物序列為：miR-10a 上游引物為5′-ACATCATACCCTGTAGAACCGAA-3′，下游引物為5′-GATTGGATGTTCTCCACAGTCTC-3′；內參GAP?DH上游引物為5′-GTGGTCTCCTCTGACTTCAAC-3′，下游引物為5′-CCTGTTGCTGTAGCCAAATTC-3′。以2-??Ct法表示小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內miR-10a的相對表達量。

1.6 兩組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白檢測 采用Western blotting 法。將剝離的頭臂干動脈粥樣硬化血管組織放入滅菌的研磨器中，加入細胞裂解緩沖液RI?PA，放于冰上30 min，4 ℃條件下14 000 r/min 離心10 min，收集上清液即為可溶性蛋白，應用BCA 法檢測可溶性蛋白的濃度，然后制備SDS-PAGE 膠，將制備好的SDS-PAGE 膠放入電泳槽內進行電泳，SDSPAGE 電泳分離蛋白后再轉膜至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉封閉，并于4 ℃冰箱中一抗孵育過夜，TBST充分洗滌后加入相應二抗，室溫孵育2 h，ECL 顯色后于化學發光凝膠成像系統中顯影，以GAPDH 為內參，IPP 6.0軟件進行灰度掃描分析，以GAPDH 條帶的光密度值矯正，計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值×100%。

1.7 兩組小鼠血清中抗磷脂抗體（anti-β2GP1）滴度檢測 采用Elisa 法。將小鼠處死前先進行眼球取血，4 ℃條件下12 000 r/min 離心10 min，取其上清液即為血清，按1︰1 000 的比例進行稀釋，將質控品和稀釋樣本加入微孔反應板條中，室溫溫育30 min，洗滌3次，加入酶結合物室溫孵育15 min，再次洗滌，加入TMB 底物溶液室溫孵育15 min，加入終止液室溫孵育5 min，板式酶標儀檢測血清中antiβ2GP1滴度。

1.8 統計學方法 采用SPSS21.0 統計軟件。計量資料以±s表示，比較用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組小鼠頭臂干動脈內皮損傷情況比較 模型組在電鏡下可見內皮細胞受損、剝離、內膜增生、血管病變、表面粗糙；miR-10a 組內皮細胞完整性較好，細胞長軸與血流方向平行，細胞排列相對整齊且內膜表面相對平滑，見圖1。

圖1 電鏡下觀察兩組小鼠頭臂干動脈中內皮細胞的變化情況（箭頭處為損傷的內皮細胞）

2.2 兩組小鼠頭臂干動脈中動脈粥樣硬化斑塊面積比較 模型組小鼠頭臂干動脈中動脈粥樣硬化斑塊面積為（11 560.0 ± 731.0）μm2，miR-10a 組小鼠頭臂干動脈中動脈粥樣硬化斑塊面積為（8 779.0±461.4）μm2，兩組相比，P<0.05。

2.3 兩組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內miR-10a 相對表達量比較 模型組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內miR-10a 相對表達量為0.25 ± 0.06，miR-10a 組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內miR-10a 相對表達量為0.37 ± 0.05，兩組相比，P<0.05。

2.4 兩組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相對表達量比較 模型組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相對表達量分別為1.245 ±0.124、1.058 ± 0.048、0.862 ± 0.083，miR-10a 組小鼠頭臂干動脈動脈粥樣硬化斑塊內p-PI3K、p-AKT及p-mTOR 蛋白相對表達量分別為0.833 ± 0.046、0.533 ± 0.047、0.293 ± 0.050，兩 組 相 比，P均<0.05。

2.5 兩組小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平比較模型組小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平為（0.40 ±0.08）U/L，miR-10a 組小鼠血清中anti-β2GP1 滴度水平為（0.26±0.06）U/L，兩組相比，P<0.05。

3 討論

動脈粥樣硬化是一種以內皮功能障礙、內皮脂質沉積、平滑肌細胞增殖、血小板異常激活、細胞凋亡和壞死、局部和全身炎癥為特征的慢性炎癥性疾病，主要涉及先天性免疫及適應性免疫，嚴重危害著中老年人的身體健康。其中，單核細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞在調節動脈粥樣硬化促炎癥反應和動脈粥樣硬化抗炎癥反應之間的平衡發揮著重要的作用，一旦這種平衡在一些病理因素（如炎癥、內皮細胞損傷、血小板的異常活化及自身免疫性疾病）作用下遭到破壞，即可引起動脈粥樣硬化的形成［13-14］。MicroRNA 是一類約有19～24 個核苷酸的內源性、非編碼的單鏈小分子RNA［9］，它們通過與靶RNA 結合，在轉錄后抑制靶基因的表達或翻譯，從而影響細胞的增殖、凋亡或細胞周期，miR-10a 是其家族中的一員。既往研究表明［15］，主動脈弓和主動脈腎分支的動脈粥樣硬化易感區域的內皮miR-10a低于其它部位，說明miR-10a 對動脈粥樣硬化的調節具有抑制作用，但miR-10a 對動脈粥樣硬化影響的機制尚未完全清楚。為此，本研究以動脈粥樣硬化小鼠為研究對象，根據尾靜脈是否注射miR-10a過表達慢病毒，將實驗分為模型組和miR-10a 組，進而探討miR-10a對小鼠動脈粥樣硬化的機制。

APL 主要包括抗心磷脂抗體（ACL）、β2GPI 抗體及狼瘡抗凝物（LA）等［16］。當機體的免疫功能亢進時，可引發自身免疫性疾病，從而釋放大量的APL。當機體受到炎癥、內皮細胞損傷及血小板異常等病理因素作用時，內皮細胞及血小板表面的磷脂類物質充分暴露，血液中的β2GPI 即可與其結合形成復合物，此時APL 則與此復合物發生抗原-抗體反應，進而引起下游PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活。PI3K/AKT/mTOR 信號通路廣泛存在于細胞中，并參與細胞的生長、發育、調控機制［17］。PI3K 是一種蛋白激酶，當其發生磷酸化后，即可產生磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3）第二信使，PIP3 與細胞內AKT 表面的PH 特殊結構域以及磷脂酰肌醇依賴性激酶-1（PDK1）結合，從而直接導致AKT 發生磷酸化［18-19］。AKT 具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，在蛋白質的合成、細胞代謝、細胞增殖及血管生成等方面占據著重要的地位。mTOR 是磷脂酰亞胺-3激酶家族的一種，包括兩個功能多樣的蛋白復合物：mTOR 復 合 物1（mTORC1）和mTOR 復 合 物2（mTORC2）［20-21］。mTORC1 信號級聯反應由p-AKT激活，同時，mTORC2 也可磷酸化AKT。mTOR 是哺乳動物自噬信號通路的主要靶點，通過調控細胞轉錄、翻譯和細胞骨架組織，促進了蛋白質的合成、細胞周期和血管生成［22］。當上述信號通路激活后，可引起血管內皮細胞增殖和內膜增生而造成血管病變，最終引起動脈粥樣硬化發生。基于上述研究，本研究發現，miR-10a 組anti-β2GP1 滴度水平明顯下降，且p-PI3K、p-AKT 及p-mTOR 蛋白相對表達量明顯降低，差異均有統計學意義，這與上述研究一致。基于上述研究及本研究結果顯示，當miR-10a表達量增加時，其可抑制APL 介導的PI3K/AKT/mTOR 信號通路的激活而下調PI3K、AKT、mTOR 蛋白的表達，進而抑制動脈粥樣硬化的形成，減少內皮細胞的損傷。

綜上所述，尾靜脈注射miR-10a 過表達慢病毒可改善動脈粥樣硬化小鼠頭臂干動脈內皮損傷情況、縮小硬化斑塊面積，其機制與過表達miR-10a 抑制抗磷脂抗體介導的PI3K/AKT/mTOR 信號通路激活有關。