胃癌間充質(zhì)干細胞、己糖激酶2對胃癌細胞株HGC-27增殖遷移及葡萄糖代謝能力的調(diào)控作用觀察

徐靜，陳斌，徐榕蔓，朱偉

1 江蘇大學附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇鎮(zhèn)江212001；2 江蘇大學醫(yī)學院；3 南通大學附屬海安醫(yī)院檢驗科

胃癌一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率［1］。研究［2］發(fā)現(xiàn)，腫瘤基質(zhì)細胞與腫瘤細胞相互作用而促進腫瘤進展。研究［3］顯示，腫瘤細胞沃伯格效應與腫瘤發(fā)展相關，探究胃癌基質(zhì)細胞對胃癌細胞葡萄糖代謝的調(diào)節(jié)作用有利于明確胃癌發(fā)展的機制。腫瘤間充質(zhì)干細胞（TA-MSCs）作為腫瘤微環(huán)境基質(zhì)細胞促進腫瘤的發(fā)展［4］。前期研究［5］發(fā)現(xiàn)，胃癌間充質(zhì)干細胞（GCMSCs）分泌的炎性因子高于循環(huán)間充質(zhì)干細胞（MSCs）。GCMSCs通過旁分泌作用促進胃癌的增殖、遷移、腫瘤血管生成和免疫抑制環(huán)境的生成［6-7］。己糖激酶2（HK2）作為葡萄糖代謝的關鍵酶，HK2 水平的升高導致了癌細胞的惡性生物學行為，在調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉移中發(fā)揮著重要作用［8］。HK2 通過與電壓依賴性陰離子通道（VDAC）相互作用結合線粒體外膜促進糖酵解，且通過維持線粒體膜電位阻止細胞色素C 的釋放，進而抑制細胞凋亡［9-10］。研究［11］顯示，骨髓間充質(zhì)干細胞（BMMSCs）可通過上調(diào)c-Myc 促進胃癌細胞糖酵解。與BMMSCs 相比，GCMSCs 能夠產(chǎn)生更多的具有上調(diào)腫瘤細胞c-Myc 的細胞因子，包括白細胞介素8（IL-8）、白細胞介素6（IL-6）、肝細胞生長因子（HGF）等［5］。以上證據(jù)表明，GCMSCs具有調(diào)節(jié)HK2的潛力。GCMSCs 能否調(diào)節(jié)胃癌細胞株HGC-27 的HK2 表達及通過調(diào)節(jié)HK2 對胃癌發(fā)展的影響尚不明確。2019年3月—2020年6月，本研究觀察了GC?MSCs、HK2 對胃癌細胞株HGC-27 增殖遷移及葡萄糖代謝能力的調(diào)控作用，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人胃癌細胞株HGC-27 購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫（北京）。胎牛血清（FBS）、RPMI 1640 培養(yǎng)基、α-MEM培養(yǎng)基購自以色列Biolhd 公司，脂質(zhì)體2000（Lipo?fectamine?2000）購自美國賽默飛科技公司，HK2 小干擾RNA（siHK2）購自廣州市銳博生物科技有限公司，兔抗人HK2 單克隆抗體、兔抗人β 肌動蛋白（βactin）單克隆抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記羊抗兔抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司，細胞計數(shù)試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，乳酸檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，6孔、48孔和96孔透明平底培養(yǎng)板購自美國康寧公司。BX41 熒光顯微鏡購自日本Nikon 公司，800TS 酶標儀、Mini-PROTEAN Tetra 電泳儀購自美國Bio-Rad公司，LAS4000 Mini化學發(fā)光曝光系統(tǒng)購自德國GE 公司，生化分析儀XD811 購自迅達公司。

1.2 細胞分組、siHK2 轉染及GCMSCs 條件培養(yǎng)基（GCMSC-CM）的用法 HGC-27 細胞用含10% FBS的RPMI 1640 營養(yǎng)液培養(yǎng)，所有細胞均放置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。GC?MSCs 生長至80%細胞融合度，棄培養(yǎng)基，經(jīng)PBS 洗滌3 次，加入含10% FBS 的α-MEM，細胞置于37 ℃5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集細胞上清液，1 000×g離心5 min去除細胞碎片，獲得GCMSC-CM。GCMSC-CM 以1∶1 的比例與含10%FBS 的新鮮培養(yǎng)基混合，混合體系用于胃癌細胞的培養(yǎng)。取對數(shù)生長期HGC-27 細胞分為4 組，GCMSC-CM 組加入GC?MSC-CM 培養(yǎng)，siHK2 組轉染HK2 小干擾RNA（si?HK2），siHK2 + GCMSC-CM 組轉染siHK2 后再加入GCMSCs 條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照組加入含10% FBS的RPMI 1640 營養(yǎng)液培養(yǎng)。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用于后續(xù)實驗。

1.3 各組細胞中HK2 蛋白檢測 采用Western Blotting 法。取生長狀態(tài)良好的各組細胞1×106個加入100 μL RIPA 裂解液震蕩15 s，冰上溫育10 min，重復3次，測定蛋白質(zhì)濃度后，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離電泳，蛋白分子量區(qū)域充分分離后停止電泳，蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入兔抗人HK2單克隆抗體（稀釋度1︰1 000），兔抗人β-actin 單克隆抗體（稀釋度1︰1 000）4 ℃孵育過夜，TBST 洗滌10 min，重復3 次，加入HRP 標記羊抗兔抗體（稀釋度1︰3 000），37 ℃孵育1 h，PVDF 膜經(jīng)TBST 洗滌后使用ECL 試劑盒檢測，使用Image J 對條帶進行灰度掃描，計算目的蛋白質(zhì)相對表達量。目的蛋白質(zhì)相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.4 各組細胞增殖能力觀察 采用CCK-8 法。取生長狀態(tài)良好的各組細胞以5×102個接種于96 孔板，加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，利用多孔平板閱讀器測量各孔450 nm 處的OD 值，以OD 值表示各組細胞增殖能力。實驗重復三次，取平均值。

1.5 各組細胞遷移能力觀察 采用Transwell 實驗。取生長狀態(tài)良好的各組細胞以6×104個滴加于Transwell 小室上室，將600 μL 含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基滴加于Transwell 小室下室，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)12 h，用棉簽將未遷移的細胞去除，4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色10 min，PBS 洗滌3 遍，顯微鏡下隨機選取3 個視野，計數(shù)遷移細胞數(shù)。實驗重復三次，取平均值。

1.6 各組細胞葡萄糖代謝能力觀察 取生長狀態(tài)良好的各組細胞以1×106個/mL 的濃度接種于48 孔板，37 ℃、5% CO2濕潤環(huán)境中培養(yǎng)8 h，收集細胞上清，經(jīng)800×g離心10 min，使用己糖激酶法和半自動生化分析儀檢測各組細胞培養(yǎng)上清中葡萄糖濃度，葡萄糖吸收量為培養(yǎng)基葡萄糖濃度減細胞培養(yǎng)后上清葡萄糖濃度所獲差值。采用乳酸檢測試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中的乳酸含量。葡萄糖吸收量或乳酸產(chǎn)生越多表示其葡萄糖代謝能力越強。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism 6 統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中HK2 蛋白相對表達量比較 對照組、GCMSC-CM 組、siHK2 組、siHK2+GCMSC-CM 組細胞中HK2 蛋白相對表達量分別為0.27 ± 0.02、0.56 ± 0.03、0.13 ± 0.01、0.14 ± 0.01，其中siHK2組與siHK2+GCMSC-CM 組細胞中HK2蛋白相對表達量相比，P>0.05，其余組間細胞中HK2 蛋白相對表達量相比，P均<0.05。

2.2 各組細胞增殖能力比較 對照組、GCMSC-CM組、siHK2 組、siHK2 + GCMSC-CM 組OD 值分別為0.56 ± 0.08、0.80 ± 0.09、0.27 ± 0.05、0.32 ±0.01，其中siHK2 組與siHK2+ GCMSC-CM 組OD 值相比，P>0.05，其余組間OD值相比，P均<0.05。

2.3 各組細胞遷移能力比較 對照組、GCMSC-CM組、siHK2 組、siHK2 + GCMSC-CM 組遷移細胞數(shù)分別 為（39.00 ± 3.46）、（82.33 ± 2.96）、（14.00 ±2.52）、（18.33 ± 3.76）個，其中siHK2 組與siHK2 +GCMSC-CM 組遷移細胞數(shù)相比，P>0.05，其余組間遷移細胞數(shù)值相比，P均<0.05。

2.4 各組細胞葡萄糖代謝能力比較 各組細胞葡萄糖代謝能力比較見表1。

表1 各組細胞葡萄糖代謝能力比較（±s）

表1 各組細胞葡萄糖代謝能力比較（±s）

注：與對照組相比，*P<0.05；與GCMSC-CM組相比，＃P<0.05；與siHK2組相比，△P<0.05。

組別對照組GCMSC-CM組siHK2組siHK2+GCMSC-CM組葡萄糖吸收量（mmol/L）4.65±0.24 7.30±0.48*3.13±0.25*＃3.20±0.15*＃△乳酸含量（mmol/L）7.38±0.39 11.34±0.69*5.17±0.30*＃5.27±0.16*＃△

3 討論

前期研究［11］發(fā)現(xiàn)，BMMSCs 通過上調(diào)胃癌細c-Myc 促進胃癌細胞的增殖。轉錄因子c-Myc 能夠調(diào)節(jié)多種細胞代謝酶，包括HK2［12］。HK2 調(diào)節(jié)細胞糖酵解，同時其在腫瘤進展、心肌損傷修復、肺纖維化及內(nèi)皮細胞生成中具有重要調(diào)節(jié)作用。循環(huán)MSCs在腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生的趨化因子作用下定殖于腫瘤部位，在腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中其它基質(zhì)細胞的作用下轉變?yōu)镚CMSCs。GCMSCs 相對于BMMSCs 具有較強的促胃癌發(fā)展的作用。細胞因子芯片分析［13-14］表明，GCMSCs 相對于BMMSCs 能夠產(chǎn)生更多的細胞因子，包括IL-8、IL-6、HGF 等，這些細胞因子可通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B（AKT）、信號傳導及轉錄激活蛋白（STAT）等信號調(diào)節(jié)c-Myc 的表達。因此，我們探究了GCMSCs 旁分泌作用對胃癌細胞株HGC-27 的HK2 表達及通過調(diào)節(jié)HK2 對胃癌細胞株HGC-27 的發(fā)展的影響。GCMSCs 可分泌多種生物活性物質(zhì)包括細胞因子、趨化因子和外泌體，細胞因子及趨化因子通過作用于細胞表面及細胞內(nèi)受體激活細胞信號進而調(diào)節(jié)胃癌細胞糖代謝。外泌體含有多種蛋白及核酸物質(zhì)具有激活細胞信號、調(diào)節(jié)轉錄和蛋白翻譯后修飾的作用。調(diào)節(jié)胃癌細胞糖酵解的關鍵細胞因子和主要途徑還有待于進一步探究。腫瘤細胞代謝重編程有利于腫瘤細胞在缺血、缺氧的腫瘤微環(huán)境中存活。HK2 的磷酸化有助于促進腫瘤的發(fā)展及促進心臟損傷修復。本研究在體外環(huán)境探究了HK2 表達促進胃癌細胞株HGC-27 增殖、遷移和葡萄糖代謝。GCMSCs 是上調(diào)胃癌細胞株HGC-27 的HK2 表達的關鍵因素。GCMSCs 促進胃癌細胞株HGC-27 增殖、遷移及葡萄糖代謝依賴于胃癌細胞株HGC-27的HK2表達。但GCMSC-CM 對胃癌細胞株HGC-27 的HK2 活性及對其磷酸化修飾的作用尚未探究。

研究者曾合成小分子抑制劑靶向抑制腫瘤HK2 用于腫瘤治療，但因藥物的療效和安全性問題未能實現(xiàn)臨床應用［15］。本研究發(fā)現(xiàn)GCMSCs 可通過旁分泌作用上調(diào)胃癌細胞株HGC-27 的HK2 表達促進胃癌發(fā)展。BMMSCs 在向GCMSCs 轉化的過程中包含多種細胞信號的激活包括核因子κB（NF-κB）、STAT 信號，這些信號都可成為阻斷GCMSCs 旁分泌作用的新靶點。GCMSCs 高表達具備上調(diào)胃癌細胞HK2 表達的細胞因子，包括IL-8、IL-6、HGF 等。這些細胞因子及其受體的研究已較明確。目前，滿足臨床應用的IL-8、IL-6 及HGF 細胞因子中和抗體及受體抑制劑在研發(fā)和改進中。小分子阻斷劑或治療抗體可通過抑制信號分子活性或阻斷細胞信號受體有效的抑制細胞間信號的傳遞。因此，明確GC?MSCs 調(diào)節(jié)胃癌細胞糖代謝的關鍵分子是實現(xiàn)靶向治療胃癌的關鍵。

綜上所述，加入GCMSC-CM 可提高HGC-27 細胞的增殖遷移及葡萄糖代謝能力，下調(diào)HK2 表達可抑制HGC-27 細胞的增殖遷移及葡萄糖代謝能力。阻斷GCMSCs旁分泌作用或抑制胃癌細胞HK2表達可能成為胃癌治療新靶點。