Th17/Treg細胞平衡關系及其相關細胞因子在絕經后骨質疏松癥發病機制中的作用研究*

羅 干 楊 虹 顧祖超 孫天威 張學磊

1 四川省成都市中西醫結合醫院骨科 610041； 2 成都中醫藥大學醫學和生命科學學院/附屬生殖婦幼醫院； 3 天津市人民醫院脊柱外科

骨質疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種以骨量低下、骨微結構破壞為特點，進而導致骨脆性增加和易于骨折為特征的全身性骨骼疾病[1]。絕經后骨質疏松癥(PMOP)是一種與雌激素缺乏直接相關，骨密度降低、骨組織顯微結構破壞為特征，導致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病[2]。因其高發病率、高致殘率、高死亡率的特點日漸成為一個世界性的健康問題，患者其他類型骨折如椎體骨折、前臂遠端骨折等發生率也相應增高[3]。因此關于PMOP發病機制、治療以及預防的研究一直都是骨科領域的熱點。Arron等[4]提出骨免疫學概念，認為在骨質疏松癥的發生發展過程中，免疫系統和免疫因子起到了至關重要的作用。Takayanagi等研究證明T細胞可分泌相關因子阻止骨吸收細胞的激活和生長。絕經后骨質疏松被認為是一種免疫炎癥過程。Th17細胞加重炎癥反應，國內外文獻報道顯示Th17可參與PMOP的發病。Treg細胞具有免疫抑制功能，可抑制骨質破壞。而關于Th17/Treg細胞平衡關系及其相關細胞因子在PMOP中的機制尚不明確，因此本研究通過觀察PMOP外周血中Th17/Treg細胞平衡變化，探討其在PMOP發病機制中的可能作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機選取2018年3月—2019年3月成都市第一人民醫院骨科住院確診的PMOP患者47例(實驗組)，年齡54～75歲，平均年齡(64.5±5.8)歲，其中骨質疏松患者均為單純骨質疏松住院病例，因骨質疏松致疼痛入院治療。選取同期健康絕經后體檢者49例(對照組)，年齡55～79歲，平均年齡(65.8±6.2)歲。實驗組所有患者均符合原發性骨質疏松癥診療指南(2017)診斷標準[5]。納入標準：自然絕經1年以上的婦女，原發性絕經后骨質疏松患者，無其他并發疾病者。排除標準：存在除骨質疏松外其他代謝疾病或影響骨代謝的疾病者；患有嚴重的慢性疾病者；排除惡性腫瘤患者；存在影響骨代謝藥物史者。兩組在年齡上沒有統計學差異(P>0.05)。且均已簽署知情同意書，研究得到成都市第一人民醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集：于早晨7：00—8：00抽取空腹全血5ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝處理。離心3 000r/min，離心10min，分裝血漿，按常規方法提取外周血單個核細胞，采集兩組年齡、體質量指數(BMI)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、骨密度(BMD)的臨床檢查數據。其中骨密度(BMD)采用雙能X線吸收測定法(Dual Energy X-ray Absorptiometry，DXA)檢測患者腰椎(L2～4)骨密度以BMD表示,測得的骨密度值與白種人同性別年輕人峰值骨量相差的標準差個數即T值(Tscore)。

1.2.2 Th17、Treg細胞流式檢測：空腹抽取外周血3ml，肝素鈉抗凝。(1)Th17細胞數量及比例：早晨空腹抽取全血4ml，EDTA抗凝處理，1h內提取PBMCs，加入莫能霉素、離子霉素、佛波醇乙酯刺激，CO2細胞培養箱4h，然后加入異硫氰酸熒光素(FITC)染色的抗人CD3 mAb及藻紅蛋白(PE)-抗人CD8 mAb，下一步加入固定液后破膜，再加入PERCP-CY5.5抗人IL-17A，加入固定液200μl，上機檢測。(2)檢查兩組外周血PBMCs中Treg細胞數量：避光加入FITC-抗人CD3 mAb，PE-抗人CD8mAb，置于CO2細胞培養箱1h,加入同定液，避光1h,然后加入穿膜液，避光1h，再加入PERCP-CY5.5抗人FOXP3孵育2h，加入固定液200μl，上機待測；用Flowjo 7.6軟件分析結果。

1.2.3 ELISA測兩組外周血血漿中白介素-17(IL-17)、白介素-23(IL-23)、白介素-6(IL-6)、轉化生長因子(TGF-β)、白介素-10(IL-10)炎性因子的表達水平：按照試劑盒說明書將標準品對倍稀釋，將血漿按一定比例稀釋后，將標準品及樣品加入抗體包埋的板孔內，37℃下孵育，后洗滌3次，加入檢測液A及B液，37℃下孵育，然后加入底物反應液，置于37℃下孵育，最后加入反應終止液。使用酶標儀對實驗結果檢測。操作方法根據試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 臨床資料比較 實驗組BMI、BMD、T值顯著低于對照組(P<0.05)，其余臨床資料未見顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 Th17、Treg細胞比例比較 實驗組外周血Th17細胞比例高于對照組(P<0.05)。實驗組外周血Treg細胞比例低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組Th17、Treg細胞表達水平比較

2.3 外周血IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β、IL-10炎性因子表達水平比較 實驗組血漿中IL-17、IL-23、IL-6表達水平均高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。實驗組血漿中TGF-β、IL-10表達水平均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組細胞因子表達水平比較

2.4 臨床資料相關性分析 Spearman相關性分析發現實驗組的Th17與IL-17呈正相關(r=0.775,P=0.041)，與BMD負相關(r=-0.734,P=0.045)；實驗組患者Treg比例與BMD、TGF-β均呈正相關(r=0.657,P=0.036；r=0.647,P=0.041)，其余指標間無顯著相關性。見表4、表5。

表4 實驗組Th17細胞與各指標相關性分析

表5 實驗組Treg細胞與各指標相關性分析

3 討論

大多數的研究發現T細胞上存在著雌激素受體，血清中雌激素水平的濃度變化可以使激素與受體結合產生不同的效應信號。絕經后婦女最顯著的特征是雌激素水平降低，在體內T細胞上的雌激素受體接收到體內雌激素極度降低的信號后，直接影響T細胞特異亞群的增值、活化[6-7]。根據T細胞分化可知，Th17/Treg細胞功能相互抑制、負向調控。但它們的分化都需要TGF-β，當TGF-β單獨存在時初始T細胞向Treg細胞分化，而存在感染或炎癥時，IL-6、TGF-β同時增高，可誘導初始T細胞向Th17分化[8]。研究顯示，Treg細胞通過負反饋抑制破骨細胞的形成及分化[9]，在骨代謝平衡中發揮著至關重要的作用。Foxp3是Treg細胞的重要轉錄因子，提示產生的Treg細胞可通過分泌TGF-β、IL-10等細胞因子發揮免疫抑制調節作用，而參與抑制破骨，減少骨吸收[10]。本研究結果顯示，實驗組絕經期女性骨質疏松患者與對照組絕經期無骨質疏松患者相比，實驗組Th17顯著升高、Treg顯著降低；同時，在實驗組BMD與Th17呈負相關，與Treg呈正相關。該結果提示在PMOP患者可能存在Th17/Treg平衡失衡。PMOP患者Th17比例上調，Treg比例下降，推測該結果可能是由于Th17可作為主要的促炎性細胞因子大量表達RANKL，RANKL可以作用于破骨細胞前體，從而誘導破骨分化的發生[11]。本研究發現，參與骨代謝的相關細胞因子，如參與Th17細胞分泌或調節的細胞因子IL-17、IL-23、IL-6表達水平顯著增高，既往研究結果表明Il-17、IL-23可協助骨破壞發生[12]，IL-23、IL-6、IL-17共同存在進一步誘導初始T細胞向Th17細胞分化，使得IL-17大量產生，從而形成一個鏈式效應，使破骨效應持續，使得骨質疏松進一步加重。本研究中TGF-β、IL-10降低，可能因Treg細胞比例降低致其產生的細胞因子TGF-β、IL-10相應減少。實驗組的BMD顯著低于對照組，顯示實驗組的患者骨質疏松情況重，而BMI在實驗組顯著低于對照組。BMI是國際上常用的衡量人體肥胖程度和是否健康的重要標準，既往研究也發現骨密度與BMI呈正相關關系[13],其原因有研究認為增加體重有助于加強骨骼的強度，延緩骨質疏松的發生和降低OP程度有關[14-15]。

綜上所述，實驗組外周血中Th17細胞比例增高、Treg細胞比例降低，且Th17相關細胞因子IL-17、IL-23、IL-6表達水平增高，Treg相關細胞因子TGF-β、IL-10表達水平降低，說明在本研究中Th17/Treg失衡，初始T細胞向Th17分化，加重PMOP骨質疏松。同時，BMI可能作為PMOP的危險因素。但本研究納入的研究樣本較少，研究結果尚有局限，后期可進一步加大樣本量同時可進一步對PMOP患者的Th17進行阻斷觀察進一步骨量丟失情況，以期為PMOP的發病機制及臨床治療提供參考依據。