穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶BGC823細(xì)胞系的構(gòu)建

王 琳， 張紫怡， 金 靜， 段海瀟， 王潤楊， 胡 翰， 汪 洋， 劉濱磊

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院， 湖北 武漢 430068)

圖 1 BGC823細(xì)胞對(duì)不同濃度嘌呤霉素敏感性曲線

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC823-Fluc單克隆細(xì)胞純度

圖 3 BGC823細(xì)胞與FLuc-BGC823細(xì)胞生長對(duì)比

圖 4 相對(duì)熒光值與細(xì)胞數(shù)目的相關(guān)性曲線

圖 5 活體動(dòng)物拍攝裸鼠腹腔植瘤

胃癌的形態(tài)學(xué)、分子特征復(fù)雜，具有高度異質(zhì)性，為了鑒定病理和分子生化機(jī)制，已經(jīng)在大鼠和小鼠中建立了各種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1]。生物發(fā)光是存在于生物體內(nèi)的一種特殊類型的發(fā)光現(xiàn)象，主要指在酶的催化作用下將生物能轉(zhuǎn)化成光能的過程，而不依賴于有機(jī)體對(duì)光的吸收[2]。生物發(fā)光成像技術(shù)具有非侵襲性、可定量、高靈敏度、操作簡單，以及能夠?qū)崟r(shí)及連續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[3]。

熒光素酶(luciferase)報(bào)告系統(tǒng)是生物發(fā)光最常見的系統(tǒng)之一，是luciferase 以熒光素(luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2為底物，在Mg2+存在時(shí)發(fā)生酶促反應(yīng)產(chǎn)生光子的過程[4]。熒光素酶報(bào)告基因被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建特殊的單克隆細(xì)胞系，用于抗腫瘤藥物的篩選。被熒光素酶標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞可通過腹腔植瘤到動(dòng)物體內(nèi)，可用生物發(fā)光成像儀進(jìn)行檢測(cè)。柯宗煌等人構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的B16R細(xì)胞系，并構(gòu)建適用于小動(dòng)物活體成像觀察的C57 小鼠皮下移植瘤模型[5]。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是重要的探針分子，廣泛應(yīng)用于標(biāo)記特定分子或細(xì)胞[6]，其缺陷是不能像酶一樣有信號(hào)放大作用[7]，表達(dá)量低時(shí)不易檢測(cè)。熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞檢測(cè)時(shí)需添加熒光素酶底物，可快速、無創(chuàng)地進(jìn)行活體檢測(cè)，具有較高的靈敏性、特異性和組織穿透能力，適用于體內(nèi)成像[8]。熒光蛋白作為一種自發(fā)熒光，受到激發(fā)光源后可在倒置顯微鏡下觀察到，因?yàn)樽园l(fā)熒光的體內(nèi)成像可能被生物體內(nèi)部一些組織干擾，比較適用體外的相關(guān)研究。本研究構(gòu)建含單色熒光素酶以及GFP綠色熒光蛋白的BGC823細(xì)胞系，形成雙熒光標(biāo)記，生物發(fā)光和熒光成像的優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用在一起，在實(shí)際應(yīng)用中有更多兼容性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞株(BGC823)購于北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心；細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是DME/F-12(HyClone， USA)；lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑盒購于Thermo Fisher Scientific 公司；PiggyBac-Dual-Promoter-Firefly Luciferase( PBDP-FLUC) 重組質(zhì)粒和PBDP 轉(zhuǎn)座酶， 本實(shí)驗(yàn)室提供。 大腸桿菌菌株DH5α，本團(tuán)隊(duì)制備；質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒(天根生物公司)。嘌呤霉素和MTS購自碧云天生物；BD流式細(xì)胞檢測(cè)儀，倒置熒光顯微鏡，Nikon公司)。多功能酶標(biāo)儀Thermo Fisher Scientific；熒光素酶底物(翊圣)；北京東聯(lián)生物安全柜。

1.2 質(zhì)粒的提取

從-80℃超低溫冰箱中取出用甘油保存的PBDP-FLuc質(zhì)粒大腸桿菌。該質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存，在室溫快速解凍后以1∶1000的比例與LB液體培養(yǎng)基混勻，放37°C搖床1600 r/min進(jìn)行搖菌15 h。質(zhì)粒提取按照天根小提質(zhì)粒試劑盒說明書操作。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

BGC823細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化并將BGC823細(xì)胞并傳代至24孔板105個(gè)細(xì)胞每孔，細(xì)胞存活率97%。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，質(zhì)粒PBDP-FLuc和PBDP-transposase以5∶1比例根據(jù)Lip3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。 BGC823細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后在倒置顯微鏡的藍(lán)光和白光下可觀察到GFP陽性率。

1.4 細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)及單克隆篩選

將細(xì)胞擴(kuò)培到T 25瓶后，鋪24孔板。當(dāng)24孔板中細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%時(shí)，棄去原細(xì)胞培養(yǎng)液。分別配置含嘌呤霉素濃度為1 、2 、 3、4、5、6、 7、 8、 9、10 μg/mL的DME/F12完全培養(yǎng)基，各3mL；給24孔板做好嘌呤霉素濃度標(biāo)記，分別將含嘌呤霉素的DME/F12培養(yǎng)基加入對(duì)應(yīng)孔，每種嘌呤霉素濃度設(shè)置3個(gè)孔平行對(duì)照。將24孔板轉(zhuǎn)移至CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為37℃，CO2濃度設(shè)置為5%進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，連續(xù)觀察細(xì)胞狀態(tài)，2 d更換一次培養(yǎng)基，最終以第4天殺死24孔板中所有細(xì)胞的最低嘌呤霉素濃度為最佳嘌呤霉素篩選濃度。

有限稀釋法獲得BGC823單克隆，用DME/F12完全培養(yǎng)基(含10% FBS)將細(xì)胞稀釋至1000個(gè)/mL。取干凈無菌96孔板，每孔中加入100 μL DME/F12完全培養(yǎng)基(含10%FBS)，再加入稀釋后的細(xì)胞懸液1 μL，于 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后(7 d左右)，在倒置顯微鏡下觀察，記錄只有單個(gè)細(xì)胞增殖成團(tuán)的孔。繼續(xù)在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80%，在倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)細(xì)胞發(fā)光情況，觀察到一個(gè)孔全部細(xì)胞均發(fā)光后， 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，依次擴(kuò)大到24孔板、6孔板，再到T-25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞長滿T-25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶。每個(gè)細(xì)胞樣品取106個(gè)用于后續(xù)流式檢測(cè)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC823-FLuc細(xì)胞純度

用流式細(xì)胞儀對(duì)BGC823-FLuc單克隆細(xì)胞系進(jìn)行純度鑒定。分別收集BGC823細(xì)胞和BGC823-FLuc細(xì)胞各106個(gè)于EP管中，將細(xì)胞懸液離心(800 r/min×4 min)，棄去舊培養(yǎng)液，加入1 mL PBS洗滌，離心(800 r/min× 4min)，加500 μL PBS重懸，將上樣密度調(diào)整為2×106個(gè)/mL，過細(xì)胞濾網(wǎng)，流式細(xì)胞儀設(shè)置上樣細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，檢測(cè)細(xì)胞純度，純度大于98%即為單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。

1.6 MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力與生長曲線

取5塊干凈無菌96孔板，將培養(yǎng)的BGC823細(xì)胞和BGC823-FLuc細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后，接種到同一塊96孔板中(共3個(gè)平行孔)，每孔加100 μL密度為5×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃恒溫，5% CO2濃度進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。5塊96孔板的培養(yǎng)時(shí)間分別為0、24、48、72、96 h。

培養(yǎng)結(jié)束后參照MTS說明書進(jìn)行如下操作：加入MTS 20 μL，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，置于多功能酶標(biāo)儀上，在490 nm波長處，以培養(yǎng)基所在孔測(cè)定的吸光度值作為背景值，計(jì)算時(shí)所有樣品測(cè)定的吸光度值均減去背景值。生長曲線的縱坐標(biāo)是吸光度值，橫坐標(biāo)是BGC823細(xì)胞數(shù)目，Excel繪制細(xì)胞生長曲線。

1.7 熒光素酶活性鑒定

細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，梯度稀釋后加入到96孔板中，每孔100 uL，BGC823-FLuc細(xì)胞數(shù)分別為5×104、2.5×104、1.25×104、6250、3125、1563個(gè)，每種密度設(shè)置4個(gè)平行孔。設(shè)置對(duì)照孔，加入100 uL PBS 緩沖液，設(shè)置4個(gè)平行孔。按照熒光素酶底物使用說明書，全程避光，各孔均加入稀釋50倍的熒光素酶底物100 uL，使熒光素酶底物濃度為0.15 mg/mL，培養(yǎng)箱孵育5 min，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)化學(xué)發(fā)光。

1.8 BGC823細(xì)胞和BGC823-FLuc細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選取5～6周齡裸鼠9只，分成3組，每組3只。對(duì)第一組裸鼠均腹腔注射100 μL，密度為5×106個(gè)/mL的BGC823-FLuc細(xì)胞；對(duì)第二組裸鼠均腹腔注射100 μL，密度為5×106個(gè)/mL的BGC823細(xì)胞；對(duì)第三組裸鼠腹腔注射100 μL PBS緩沖液。接種7 d后，按照熒光素酶底物使用說明書，腹腔注射熒光素酶反應(yīng)底物，底物用量30 mg/mL，100 μL/只，讓裸鼠自由活動(dòng)10 min后，麻醉裸鼠，再進(jìn)行動(dòng)物活體成像，拍攝記錄三組裸鼠體內(nèi)熒光素酶發(fā)光情況。

2 結(jié)果

2.1 BGC823細(xì)胞對(duì)嘌呤霉素敏感性實(shí)驗(yàn)

通過查閱文獻(xiàn)，選取嘌呤霉素的濃度范圍為1～10 μg/mL進(jìn)行細(xì)胞敏感性實(shí)驗(yàn)。通過最終繪制曲線可知，4天內(nèi)殺死所有細(xì)胞的最低嘌呤霉素濃度為6 μg/mL。因此6 μg/mL作為嘌呤霉素加壓篩選的最佳濃度。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BGC823-FLuc細(xì)胞純度

對(duì)穩(wěn)轉(zhuǎn)BGC823-FLuc細(xì)胞與BGC823細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定。通過對(duì)比兩者流式檢測(cè)結(jié)果可知，F(xiàn)L1-A+表示GFP陽性率，與對(duì)照組相比GFP陽性率為99.9%，說明BGC823-Fluc單克隆細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.3 MTS實(shí)驗(yàn)測(cè)定BGC823細(xì)胞與BGC823-FLuc細(xì)胞生長曲線

MTS法檢測(cè)BGC823細(xì)胞活力值。OD 490顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了熒光素酶基因的細(xì)胞在0、24、48、72、96這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸光度值差異無顯著性(P>0.05)，說明穩(wěn)轉(zhuǎn)熒光素酶基因?qū)GC823細(xì)胞增殖幾乎無影響。

2.4 熒光素酶檢測(cè)

以細(xì)胞數(shù)目為橫坐標(biāo)，相對(duì)熒光值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞數(shù)目與相對(duì)熒光值的相關(guān)性曲線，相對(duì)熒光值和BGC823-Fluc細(xì)胞數(shù)目成正比例關(guān)系，且細(xì)胞數(shù)目和相對(duì)熒光值相關(guān)性為0.9791，說明熒光素酶在單克隆細(xì)胞系中表達(dá)。

2.5 BGC823-FLuc和BGC823裸鼠腹腔植瘤結(jié)果

裸鼠腹腔進(jìn)行BGC823-Fluc和BGC823細(xì)胞注射后，7 d后腹腔注射熒光素酶反應(yīng)底物30 mg/mL，100 μL/只，讓裸鼠自由活動(dòng)10 min后，在動(dòng)物活體成像系統(tǒng)中檢測(cè)裸鼠體內(nèi)發(fā)光情況。第一組3只裸鼠體內(nèi)注射BGC823-Fluc，活體動(dòng)物成像顯示，3只老鼠體內(nèi)均能檢測(cè)到熒光，可以通過熒光來判斷裸鼠體內(nèi)腫瘤進(jìn)展。第二組3只裸鼠體內(nèi)注射BGC823，未檢測(cè)到熒光。第三組3只裸鼠體內(nèi)注射PBS，也未檢測(cè)到明顯熒光。

3 討論與結(jié)論

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將含GFP和熒光素酶的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞(BGC823)中，經(jīng)過嘌呤霉素加壓篩選，有限稀釋法挑選單克隆，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，MTS實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞活力鑒定并繪制生長曲線，流式細(xì)胞儀鑒定，陽性率為99.9%，表明成功構(gòu)建表達(dá)GFP及熒光素酶基因(FLuc)的胃癌細(xì)胞系(BGC823-FLuc)。葛曉梅等構(gòu)建的人胃癌細(xì)胞系顯示PDX模型來源的腫瘤細(xì)胞系不能完全替代PDX模型，需要和PDX模型結(jié)合使用[9]，在單個(gè)細(xì)胞系中結(jié)合不同的生物讀數(shù)提供了優(yōu)于常規(guī)基于細(xì)胞的測(cè)定的顯著優(yōu)勢(shì)，并接種到裸鼠皮下，建立裸鼠胃癌細(xì)胞模型，結(jié)合動(dòng)物活體成像技術(shù)監(jiān)測(cè)腫瘤的生長過程。

這一模型的成功構(gòu)建，能夠?yàn)槲赴┲委熕幬锖Y選、胃癌免疫學(xué)治療、腫瘤的聯(lián)合治療手段等動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)提供極的大便利，能夠讓觀察者直觀而精確地判斷腫瘤在體內(nèi)的進(jìn)展。與綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白等報(bào)告基因相比，熒光素酶靈敏度更高，穩(wěn)定性更好，背景干擾更低，在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性更強(qiáng)[10-13]，使熒光素酶報(bào)告基因在腫瘤治療和其他生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。