能力驗證乳粉樣品中 雙歧桿菌計數培養基的選擇探究

勞嘉倩，蔣佳希，尹瑋璐

（廣州市食品檢驗所，廣東廣州 510410）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一類嚴格厭氧的革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在于人和動物體內，具有抗菌、抗感染、免疫調節、降低膽固醇、抗腫瘤等多種生理功能[1-4]，是人體內重要的益生菌。目前，雙歧桿菌在醫學、功能性食品、保健食品等方面有較深入的研究，被廣泛應用于各種乳制品中。

隨著食品行業的快速發展，消費者對食品的安全性和質量要求越來越高，我國食品微生物標準《食品安全國家標準 嬰兒配方食品》（GB 10765—2010）和《食品安全國家標準 較大嬰兒和幼兒配方食品》（GB 10767—2010）中明確規定添加活性菌種的產品其活性益生菌的數量要≥ 106CFU/mL，但要準確測定食品中雙歧桿菌的含量，通常受測試環境、樣品保存條件、樣品均勻性、稀釋體積、取樣體積、培養時間、培養溫度、觀察計數等多方面因素的影響[4-8]。因此，科學、準確地測定產品中雙歧桿菌等益生菌的數量十分關鍵。

能力驗證是利用實驗室間的比對判定實驗室的特定校準、檢測能力，以考察實驗室檢驗技術能力的外部質量活動[9-10]，在人員能力評估、數據準確性分析等方面具有重要意義[11-13]。為了更準確更科學全面的得出能力驗證結果，本實驗室依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗》（GB 4789.34—2016），采用人員比對及MRS瓊脂和雙歧桿菌瓊脂（BBL培養基）2種培養基對能力驗證樣品進行檢測，通過比較分析不同培養基對雙歧桿菌計算結果的差異，探究不同培養基的適用性，為實驗室進行雙歧桿菌計數培養提供培養基的選擇參考。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品20-U983和20-Z259來源于中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心。

1.2 儀器與試劑

Dilumat STRT重量稀釋儀（法國biomerieux公司）；Ⅱ級A2型生物安全柜（美國Thermo公司）；Anoxomat Ⅲ 智能化厭氧系統（荷蘭anoxomat公司）；IF450 生化培養箱（德國memmert公司）；MRS培養基（北京陸橋技術股份有限公司）；雙歧桿菌培養基（廣東環凱微生物科技有限公司）；0.85%生理鹽水（實驗室自制）；西紅柿浸出液（實驗室自制）。

1.3 實驗方法

本研究參照ACAS-PT926(2020)乳粉中乳酸菌檢驗能力驗證參試指導書、GB 4789.34—2016方法操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液至10-5。樣品稱量前要充分混勻，確保乳酸菌在樣品中分布均勻。稀釋過程中應充分均質拍打1～2 min， 10倍系列稀釋管注意要用旋渦振蕩器混勻。在進行10倍遞增稀釋的同時，吸取10-3～10-5樣品勻液1 mL于無菌平皿內，做2個平行平皿。及時將10～20 mL冷卻至46～50 ℃ 的瓊脂培養基傾注平皿，轉動平皿使其混合均勻，于（36±1） ℃ 下厭氧培養48 h，計數平板上的所有菌落數。樣品制備到平板傾注要求在15 min內完成。

分別選擇BBL培養基和MRS培養基及3名檢測員進行比對實驗。

1.4 分析方法

實驗結果采用重復性限、再現性限[14]進行分析。重復性為同一樣品使用同一培養基，由同一操作者在短時間內進行的兩次平行試驗的結果，取以10為底的對數后，絕對值差值≤0.25（即重復性限，r=0.25）。再現性為同一樣品使用不同培養基進行計數，同一操作者2次獨立試驗結果取以10為底的對數后，絕對值差值≤0.45（即再現性限，r=0.45）。人員比對再現性：同一樣品使用同一培養基進行計數，由不同操作者進行的2次獨立試驗結果取以10為底的對數后，絕對值差值不大于0.45（即再現性限，r=0.45）。

2 結果與分析

樣品使用BBL培養基和MRS培養基經（36±1）℃厭氧培養48 h后，雙歧桿菌數計數結果及計算見表1。

表1 不同瓊脂平板上的菌落計數結果

人員1的重復性分別為：r=0.11，r=0.08，r=0.01，r=0.06； 人員2的重復性分別為：r=0.06，r=0.10，r=0.04，r=0.04，人員3的重復性分別為：r=0.13，r=0.09，r=0.04，r=0.02，均低于重復性限（r=0.25），重復性均較好。

樣品Z259使用MRS培養基做人員比對，其再現性r=0.10，r=0.05，r=0.05；使用BBL培養基做人員比對，其再現性r=0，r=0.02，r=0.02。樣品U983使用MRS培養基作人員比對，其再現性均為r=0.01，使用BBL培養基作人員比對，其再現性均為r=0。以上人員比對的再現性均低于再現性限r=0.45，表明兩種培養基的穩定性均較好。最終選取人員1的計數結果進行分析及報告。

樣品Z259取稀釋度10-4進行菌落計數，在MRS培養基上的菌落計數取平均值后乘以稀釋倍數，結果為 2.3×105CFU/g。在BBL培養基上的菌落計數取平均值后乘以稀釋倍數，結果為3.4×105CFU/g。樣品Z259在BBL培養基上的菌落計數和在MRS培養基上的菌落計數的再現性r=0.17，小于再現性限（r=0.45），同一樣品在2種培養基的計數結果之間的差值不明顯。

樣品U983取稀釋度10-4進行菌落計數，在MRS培養基上的菌落計數取平均值后乘以稀釋倍數，結果為7.4×105CFU/g。 在BBL培養基上的菌落計數取平均值后乘以稀釋倍數，結果為1.2×106CFU/g。樣品U983在BBL培養基上的菌落計數和在MRS培養基上的菌落計數的再現性r=0.21，小于再現性限（r=0.45），表明2種培養基對同一樣品的計數結果之間的差值是可以接受的。

3 結論與討論

（1）本次能力驗證乳粉樣品中僅含有雙歧桿菌，按照GB 4789.34—2016的標準要求對樣品中雙歧桿菌進行計數。本次能力驗證為實驗室間評定，因MRS培養基和BBL培養基的菌落計數差異不大，考慮到BBL培養基配制煩瑣，多數實驗室更傾向于使用較為便捷的MRS培養基，故本次結果報告取MRS培養基的菌落計數，20-Z259結果報告為2.3×105CFU/g，20-U983結果報告為7.4×105CFU/g,|Z|值均小于2，結果均反饋為滿意結果。

（2）實驗所用的BBL培養基和MRS培養基均以蛋白胨作為氮源，葡萄糖或可溶性淀粉作為碳源，酵母提取物作為生長因子[15]。相同培養條件下，BBL培養基上的菌落數較MRS培養基多，可能是因為BBL培養基中含有半胱氨酸鹽，能為雙歧桿菌的生長提供更適宜的還原性環境（厭氧環境），BBL培養基額外添加了番茄汁作為天然營養物質，新鮮番茄汁富含多種維生素，能作為促進雙歧桿菌生長的雙歧增殖因子，提高雙歧桿菌的生長活力[16-17]。研究表明[18]，以3%馬鈴薯汁為碳源、3%黃豆汁為氮源、10%番茄汁作為生長因子，經37 ℃培養10 h后，活菌數比原MRS培養基增加了2.11倍。

（3）《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗》（GB 4789.34—2016）中規定的雙歧桿菌計數培養基為BBL培養基或MRS培養基，本次實驗和相關文獻均表明，相同培養條件下，BBL培養基上的活菌數較MRS培養基多，但兩者的再現性（r=0.17，r=0.21）均低于再現性限（r=0.45），表明兩者的差值明顯。因此，在日常樣品檢驗過程中，為了提高工作效率，實驗室可選用更為便捷的MRS培養基，若要盡可能多地計算樣品中雙歧桿菌含量，可選用BBL培養基進行培養計數。

（4）對于能力驗證中的實驗室間評定，如果多數實驗室都采用MRS培養基，只有個別實驗室使用BBL培養基，則結果的中位值可能偏低，采用BBL培養基的實驗室結果易會落于上四分位值上方，表現為離群值[19]，影響實驗室間評定結果的真實性與客觀性。因此，對于能力驗證中的實驗室間評定，能力驗證組織方可設置兩組不同培養基的實驗結果比對，以提高能力驗證的客觀性和真實性。

本實驗通過選取2種培養基（MRS培養基和BBL培養基）對能力驗證乳粉樣品中雙歧桿菌含量進行培養計數，發現BBL培養基的活菌數高于MRS培養基，但兩者的再現性低于再現性限，MRS培養基和BBL培養基均可作為雙歧桿菌計數培養基。在日常樣品檢驗過程中，實驗室可根據實驗需求（便捷性需求或更接近真值需求），選取相應的計數培養基。