養元通絡針法干預糖尿病胃輕癱大鼠的實驗研究

王峰　張瑤　徐俊　胡昭端　周曉紅　謝有瓊　彭銳

摘要 目的：研究養元通絡針法對糖尿病胃輕癱（DGP）模型大鼠胃竇平滑肌SCF-kit通路系統及血清胃促生長素（Ghrelin）、膽囊收縮素（CCK）、5-羥色胺表達的影響。方法：將50只SD大鼠隨機分為空白組（N）、模型組（M）、針刺組（A）、假針刺組（SA）、西藥二甲雙胍組（MET），每組10只。除空白組外，其余4組均采用鏈脲佐菌（STZ）結合高脂飲食誘導造模。各組大鼠分別于相應干預措施2周后，光鏡下觀察大鼠胃竇平滑肌形態學改變，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測血清Ghrelin、CCK、5-羥色胺表達，Western Blotting法檢測胃竇干細胞因子（SCF）、c-kit蛋白表達。結果：1）形態組織學改變：與空白組比較，模型組胃竇黏膜不完整，血管數量減少，腺體的排列紊亂，間質細胞數目減少;與模型組比較，針刺組與西藥組胃竇黏膜尚完整，腺體排列比較整齊，有較豐富血管，間質細胞數量較多;假針刺組與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。2）與空白組比較，模型組大鼠血清Ghrelin、5-羥色胺表達下降（P<0.05），CCK、血糖水平升高（P<0.05）;與模型組比較，針刺組與西藥組血清Ghrelin、5-羥色胺表達上升，CCK、血糖水平下降（P<0.05），假針刺組Ghrelin、CCK、5-羥色胺表達與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。3）與空白組比較，模型組大鼠胃竇SCF、c-kit蛋白表達降低（P<0.05）;與模型組比較，針刺組與西藥組大鼠胃竇SCF、c-kit蛋白表達升高（P<0.05）;假針刺組胃竇SCF、c-kit蛋白表達與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結論：養元通絡針法能使DGP大鼠胃竇組織內SCF和c-kit蛋白表達量提升，上調SCF-kit信號系統，提高血清Ghrelin、5-羥色胺表達，降低血清CCK表達，從而改善胃腸動力。

關鍵詞 針刺;糖尿病胃輕癱;SCF/c-kit信號通路;胃促生長素;膽囊收縮素;5-羥色胺

Experimental Study on the Effect of Nourishing Yuan and Dredging the Meridians Acupuncture in Diabetic Gastroparesis Model Rats

WANG Feng1，ZHANG Yao2，XU Jun1，HU Zhaoduan1，ZHOU Xiaohong1，XIE Youqiong1，PENG Rui1

（1 Hubei University of Traditional Chinese Medicine，Wuhan 430061，China; 2 Wuhan Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine，Wuhan 430022，China）

Abstract Objective：To study the effects of Nourishing Yuan and Dredging the Meridians Acupuncture on the SCF-kit pathway system of gastric antrum smooth muscle and the expression of serum Ghrelin，CCK and 5-HT in diabetic gastroparesis model rats.Methods：A total of 50 SD rats were randomly divided into a blank group（N），a model group（M），an acupuncture group（A），a sham acupuncture group（SA），and a metformin group（MET），with 10 rats in each group.Except the blank group，the other 4 groups were induced by streptozotocin（STZ） and combined with high-fat diet to induce modeling.Rats in each group were observed for 2 weeks after the corresponding intervention measures.Morphological changes of gastric antrum smooth muscle were observed under light microscope.Serum Ghrelin，CCK，5-HT expression was detected by ELISA method，and SCF and c-kit proteins were detected by WB method.Results：1） Morphological and histological changes：Compared with the blank group，the gastric antrum mucosa of the model group was incomplete，the number of blood vessels was reduced，the glands were arranged disorderly，and the number of interstitial cells were reduced.Compared with the model group，the gastric antrum mucosa of the acupuncture group and the western medicine group was basically complete，the glands were arranged neatly，there were abundant blood vessels and a large number of interstitial cells; there was no significant difference in the sham acupuncture group.2） Compared with the blank group，the expression of serum Ghrelin and 5-HT in the model group decreased（P<0.05），CCK and the level of blood glucose increased（P<0.05）.Compared with the model group，the expression of serum Ghrelin and 5-HT increased，the level of CCK and blood glucose decreased in the acupuncture group and the Western medicine group，but there was no significant difference in the expression of Ghrelin，CCK and 5-HT in the sham acupuncture group（P>0.05）.3） Compared with the blank group，the expression of SCF and c-kit protein in the gastric antrum of the model group decreased（P<0.05）.Compared with the model group，the expression of SCF and c-kit protein in the gastric antrum of the acupuncture group and the Western medicine group increased（P<0.05），but there was no significant difference in the expression of SCF and c-kit protein in the gastric antrum of the sham acupuncture group（P>0.05）.Conclusion：The method of mourishing Yuan and dredging the meridians acupuncture can increase the expression of SCF and c-kit protein in gastric antrum of DGP rats，up-regulate SCF-kit signal system，increase the expression of serum Ghrelin and 5-HT，and decrease the expression of serum CCK，so as to improve gastrointestinal motility.

Keywords Acupuncture; Diabetic gastroparesis; SCF/c-kit; Ghrelin; CCK; 5-HT

中圖分類號：R245;R245.9+7;R587.2文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.12.006

糖尿病胃輕癱（Diabetic Gastroparesis，DGP），又稱為糖尿病胃動力障礙，是一種慢性疾病，常以2型糖尿病患者為多見，約占糖尿病患者的50%[1]。DGP是臨床上常見糖尿病并發癥之一，是以在糖尿病基礎上伴有胃動力不足為特征的一種疾病，主要臨床表現為腹脹、早飽、厭食、惡心、嘔吐、噯氣等一系列消化道癥狀，嚴重影響了此類患者的生命質量[2]。因此，找到一種治療DGP的方法，是當今臨床面臨的難題。本研究通過腹腔注射鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ）建立DGP大鼠模型，以養元通絡針法對DGP大鼠進行干預性治療，以西藥組進行對照，觀察大鼠胃竇平滑肌形態學改變，以及血清5-羥色胺、胃促生長素（Ghrelin）、膽囊收縮素（CCK）以及胃竇SCF、c-kit蛋白表達，探索“養元通絡針法”治療DGP的相關機制，具有相當重要的學術意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔劑SD大鼠50只，體質量（200±20）g，由湖北省實驗動物研究中心提供，動物許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。經湖北中醫藥大學實驗倫理委員會批準（倫理審批號：201905-003），將動物飼養于湖北中醫藥大學實驗動物中心，普通飼料，自由飲水。

1.1.2 藥物 檸檬酸（廣州化學試劑廠，批號：20190806-2）;檸檬酸鈉（廣州化學試劑廠，批號：20190705-2）;鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma公司，美國，貨號：S0130）;鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20023371）。

1.1.3 試劑與儀器 試劑：酚紅試劑（天津恒興化學試劑公司，貨號：SHPBY-50）;Ghrelin（貨號：MA1-25658）、CCK（貨號：PA5-103116）、5-羥色胺（貨號：SE100）;ELISA試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0010）、RIPA裂解液（貨號：P0013B）、PMSF（貨號：ST506）、WB一抗稀釋液試劑盒（貨號：45-8199）和GAPDH一抗試劑盒（武漢碧云天生物公司，貨號：MA5-15738-D800）;SCF（貨號：PA5-19793）、c-kit（貨號：44-500G）、一抗試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）;HRP標記羊抗兔二抗（Cell Signaling Technology公司，貨號：MA5-15367）;RNase H（貨號：PA5-90243）、5×HiScript Buffer（貨號：R201-01）試劑（南京諾唯贊生物科技有限公司）。儀器：顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號：BX53）;冰凍切片機（Leica，德國，型號：RM2016）;針灸針（中研太和醫療器械有限公司，型號：0.20 mm×0.25 mm）;電針儀（上海華誼，型號：G6805-2A）;pH計（上海雷磁，型號：E-201F）、血糖儀（強生公司，美國，型號：OneTouch VerioVue）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將動物適應性喂養1周，禁食不禁水12 h，尾靜脈取血測空腹血糖，剔除血糖過高大鼠。將50只SD大鼠隨機分為空白組（N）、模型組（M）、針刺組（A）、假針刺組（SA）、西藥二甲雙胍組（MET），每組10只。除空白組外，其余4組均在稱重后按55 mg/kg的劑量腹腔注射1% STZ（新鮮配制在4 ℃條件下，0.1 mol/L，pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液[3]），并給予高脂飲食，并于注射后72 h采集鼠尾靜脈血測血糖值，選擇空腹血糖（FBG）≥16.65 mmol/L的成模大鼠納入實驗[4]。造模過程中，同時測量體質量，并觀察大鼠的飲食、大小便、飲水、活動情況、皮毛光澤度及死亡情況等。

1.2.2 干預方法 造模成功2 d后，給予空白組（N）和模型組（M）各灌胃1 mL生理鹽水;針刺組（A）針刺脾俞、腎俞、足三里、三陰交（取穴方法參考李忠仁制訂的“動物針灸穴位圖譜”及解剖學定位）;假針刺組選穴在標準穴位旁開5 mm處，針具選擇0.20×25 mm中研太和牌針灸針，針刺深度5 mm，針柄連接華佗電子針灸儀，選用連續波，頻率2 Hz，強度1 mA進行干預，單次干預20 min，造模后即開始干預，連續干預2周;西藥二甲雙胍組（MET）灌胃二甲雙胍0.3 g/（kg·d）治療。

1.2.3 檢測指標與方法 各組大鼠于針刺治療結束后，并禁食24 h、禁水2 h，第2天開始相應指標檢測。

1.2.3.1 血清胃促生長素（Ghrelin）、膽囊收縮素（CCK）、5-羥色胺表達的測定 用10%水合氯醛麻醉大鼠后，打開大鼠胸、腹腔，取心尖血，常溫靜置2 h后，以3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min后取上清液，按試劑盒方法和步驟，用ELISA法檢測血清Ghrelin、CCK、5-羥色胺水平。

1.2.3.2 光鏡下觀察大鼠胃竇平滑肌形態 采血結束后，迅速剖腹取0.5 cm×0.5 cm大小的胃竇組織。將胃竇部組織塊固定、洗滌、脫水及包埋，超薄切片，雙重電子染色，在電鏡下觀察并拍片。

1.2.3.3 胃竇SCF、c-kit蛋白表達的測定 采用Western Blotting法檢測胃竇SCF、c-kit的表達水平。取出凍存的胃竇組織，加入RIPA裂解液充分裂解、勻漿、離心提取蛋白，并進行電泳、濕轉膜，分別加入一抗、二抗，ECL發光液顯色后將膜置于發光體系中檢測、顯影沖洗保存，同時以GAPDH抗體作為內參，相對表達量用目標蛋白的吸光度值與GAPDH吸光度值的比值來表示。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件對研究數據進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，治療前后比較用配對t檢驗，組間比較用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模后各組大鼠空腹血糖（FBG）比較 與空白組比較，模型組大鼠血糖水平顯著升高，差異有統計學意義（P<0.5）;與模型組比較，針刺組、西藥組血糖水平降低，差異有統計學意義（P<0.5），假針刺組差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.2 各組大鼠胃竇平滑肌形態學改變的比較 空白組大鼠胃竇黏膜組織結構完整，血管豐富，腺體的排列整齊，可見較多的間質細胞。與空白組比較，模型組胃竇黏膜不完整，血管數量減少，腺體的排列紊亂，間質細胞數目減少;與模型組比較，針刺組與西藥組胃竇黏膜尚完整，腺體排列比較整齊，有較豐富血管，間質細胞數量較多。假針刺組與模型組比較，無明顯差異。見圖2。

2.3 各組大鼠血清Ghrelin、CCK、5-羥色胺表達比較 與空白組比較，模型組大鼠血清Ghrelin、5-羥色胺表達下降，血清CCK水平升高，差異均有統計學意義（均P<0.05）;與模型組比較，針刺組與西藥組血清Ghrelin、5-羥色胺表達上升，血清CCK水平下降，差異均有統計學意義（均P<0.05）;假針刺組Ghrelin、CCK、5-羥色胺表達與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3～5。

2.4 各組大鼠胃竇SCF、c-kit蛋白表達比較 與空白組比較，模型組大鼠胃竇SCF、c-kit蛋白表達降低，差異有統計學意義（P<0.05）;與模型組比較，針刺組與西藥組大鼠胃竇SCF、c-kit蛋白表達升高，差異有統計學意義（P<0.05）;假針刺組胃竇SCF、c-kit蛋白表達與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6～7。

3 討論

糖尿病胃輕癱（DGP）是糖尿病患者常見的胃腸動力障礙并發癥。近年來的研究表明，Cajal間質細胞（ICC）對于DGP發病的影響不可忽視，已證實ICC是胃腸道運動的起搏細胞，調節神經遞質，參與神經沖動的傳導[5]。DGP與ICC數量、結構或密度變化有關。ICC表達原癌基因c-kit，其天然配體為SCF，二者組成的SCF/c-kit信號系統，結合并活化酪氨酸激酶，啟動一系列磷酸化過程，在ICC的分化、生長、增殖及表型維持中具有重要作用[6]。SCF或者c-kit異常表達以及二者相結合異常，均會導致該通路的傳導異常，從而干擾ICC的正常生命活動，以致不能正常的生長、增殖、分化等，影響到胃腸的生理功能[7-8]。Ghrelin是1999年由日本科學家Kojima等發現的，主要由胃底部黏膜X/A樣細胞分泌的內源性腦腸肽，進入血液循環[9]。Ghrelin具有多種生物活性，且已被證明具有加快胃腸蠕動、保護胃黏膜、調節胃酸分泌、增強食欲等[10-12]。膽囊收縮素（CCK）是一種腸激素，已知能調節腸內分泌、膽囊收縮和腸蠕動，對腸胃功能有影響[13]。CCK無論在外周或腦內均對攝食和胃腸運動起抑制作用[14]。CCK水平與胃的排空率負相關。研究表明，CCK可通過抑制胃排空，間接降低血糖[15]。5-羥色胺是色氨酸代謝的重要產物，作用于傳入神經纖維和迷走神經纖維，與相應受體結合，從而引起胃腸道平滑肌收縮，使胃腸道張力增加，腸蠕動加快[16]。

中醫認為，糖尿病胃輕癱是以消渴為基礎的脾胃病，可以將其歸為“痞證”“嘔吐”“反胃”等范疇[17]。消渴日久，氣陰兩傷，以致脾胃虛弱。脾不升清，胃不降濁，脾胃運化失司，則生痰飲、食積、濕熱、氣滯等[18]。所以糖尿病胃輕癱屬本虛標實之證[19-20]。“養元通絡”是彭銳教授針法的核心思想，脊柱與四肢取穴相結合，從背腧穴（五臟六腑之元氣輸注于腰背部的穴位）入手，治療DGP取脾俞、腎俞，以養護脾胃之元氣，補虛瀉實，以補為主;再取四肢部足三里、三陰交穴以疏通經絡，補虛瀉實，以瀉為主。諸穴合用，達到經絡通暢，元氣充沛，標本兼治的效果。“養元通絡針法”已在臨床上驗證了其在治療胃動力不足方面的療效，為進一步探討該療法對糖尿病胃輕癱的療效和作用機制，故展開本實驗研究。

本實驗結果表明，DGP模型大鼠血糖較正常組升高，胃竇SCF、c-kit蛋白表達降低，胃竇黏膜組織較正常組不完整，血管數量減少，腺體的排列紊亂，間質細胞數目減少，血清Ghrelin、5-羥色胺表達較正常組明顯減少，CCK表達較正常組升高，提示SCF/c-kit信號通路傳導途徑表達下調、活性被抑制與DGP胃動力不足有一定相關性。干預2周后，針刺組和西藥組大鼠較模型組血糖下降，胃竇SCF、c-kit蛋白表達升高，胃竇黏膜組織比模型組完整，腺體排列整齊，血管豐富，間質細胞數量多，血清Ghrelin、5-羥色胺表達增加，血清CCK表達下降，表明養元通絡針法能提高SCF/c-kit信號通路的活性，達到改善胃腸動力的作用，并且還能使血糖下降。但是，這一過程涉及的機制十分復雜，還需要進一步深入研究。

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（2020-03-11收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：湖北省衛生健康委聯合基金立項項目（WJ2019H409）;武漢市衛生健康委中西醫結合重點項目（WZ19A02）

作者簡介：王峰（1996.12—），男，碩士研究生在讀，研究方向：中醫藥防治骨與關節疾病的研究，E-mail：984627415@qq.com

通信作者：彭銳（1967.12—），男，博士，教授，主任醫師，博士研究生導師，研究方向：骨與關節的中西醫防治研究，E-mail：974831374@qq.com