犢牛腹瀉糞便樣本中紐布病毒VP1和RNA依賴性RNA聚合酶基因的序列分析

李斯熠，岳 華,2，湯 承,2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2.動物醫(yī)學(xué)四川省高校重點實驗室，成都 610041)

紐布病毒(Nebovirus，NeV)是嵌杯病毒科(Caliciviridae)紐布病毒屬(Nebovirus)的唯一成員?；蚪M長度為7 453～7 460 bp，分為兩個開放閱讀框(ORFs)，編碼RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)、主要衣殼蛋白(VP1)和次要衣殼蛋白(VP2)等結(jié)構(gòu)[1]。由于缺乏類似其他嵌杯病毒的雙命名系統(tǒng)，因此，NeV的基因分型仍基于RdRp核苷酸或完整VP1氨基酸序列分別表述。目前，NeV可分為3種RdRp型(NB-like、NA1-like和SC-yak)和3種VP1型(基因1～3型)，其中，基因1型可進一步劃分為4個 譜系(譜系1～4)[1]。

VP1是杯狀病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，由S結(jié)構(gòu)域和P結(jié)構(gòu)域組成，P結(jié)構(gòu)域進一步分為P1和P2子結(jié)構(gòu)域，其中，P2結(jié)構(gòu)域外表面含有組織血型抗原(histo-blood group antigens, HBGAs)的結(jié)合位點和抗原中和表位[1-2]。最近研究證實，NeV MA415-KOR毒株(基因1.3型)的VP1可與多種HBGAs結(jié)合，在病毒的感染與免疫過程中發(fā)揮重要作用[3]。RdRp與RNA的復(fù)制有關(guān)，它是一種易出錯的酶，從而導(dǎo)致病毒快速進化[4]。

最近，本實驗室證實NeV在我國的奶牛和青藏高原牦牛中廣泛流行[5]。國內(nèi)NeV流行毒株的RdRp基因型有 NB-like和SC-yak型；VP1基因型有1型(包括1.1、1.3和 1.4 3個譜系)、基因2型和3型，表明我國NeV VP1蛋白具有豐富的遺傳多樣性。本研究從2019年9—11月寧夏和河南的奶牛腹瀉樣本檢測到VP1基因1.2型毒株，旨在通過分析其完整VP1和RdRp的分子特征，為進一步了解國內(nèi)NeV的遺傳多樣性提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本信息

2019年9—11月，從寧夏(8個場)和河南(5個場)分別采集了53份和58份犢奶牛腹瀉糞便樣本，共111份。所有樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 核酸的提取和反轉(zhuǎn)錄

用Trizol法提取樣本總RNA，并使用PrimeScriptTM試劑盒(TaKaRa公司)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 NeV的檢測

采用Park等[6]的RT-PCR方法對NeV進行檢測，所有擴增產(chǎn)物均由生工生物工程股份有限公司進行雙向測序，并進行BLAST比對驗證。

1.4 混合感染調(diào)查

參照相關(guān)文獻中有關(guān)牛輪狀病毒(bovine rotavirus, BRV)、牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCoV)、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)和牛諾如病毒(bovine Norovirus, BNoV)的檢測方法[7-10]，進一步調(diào)查NeV陽性樣本的混合感染情況。

1.5 完整VP1和RdRp的擴增

利用Primer 5.0設(shè)計引物用于擴增陽性樣本VP1和RdRp，引物信息見表1。陽性PCR產(chǎn)物膠回收后連接至pMD19-T，再轉(zhuǎn)入DH5α，增菌后篩選質(zhì)粒，送至生工生物工程(上海)有限公司進行雙向測序。

1.6 序列分析

使用Seqman7.0對序列進行拼接；使用MegAlign對序列進行同源性分析；使用MEGA 6.0中ClustalW進行多序列對比，并采用最大似然法構(gòu)建核苷酸或氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 NeV RdRp和VP1的擴增引物

2 結(jié) 果

2.1 NeV的RT-PCR檢測結(jié)果及混合感染情況

從111份腹瀉樣本中檢出11個NeV陽性，平均陽性率為9.91%(11/111)，平均場陽性率為61.54%(8/13)，其中，寧夏NeV陽性率為11.32%(6/53)，場陽性率為50%(4/8)；河南的陽性率為8.62%(5/58)，場陽性率為80%(4/5)。11份NeV陽性樣本中4份為NeV單獨感染，7份為混合感染，見表2。

表2 NeV與其他腹瀉病毒的混合感染

2.2 基因1.2型毒株完整VP1序列的分析

對11份NeV陽性樣本進行了完整VP1的擴增，只從寧夏和河南樣本中各成功擴增出2個完整的VP1序列，擴增結(jié)果見圖1。4個樣本完整VP1長度均為1 647 bp，編碼549 aa (登錄號為MW218190～MW218193)，核苷酸相似性為86.7%～99.9%，氨基酸相似性為96.2%～100.0%。與GenBank中36個基因1.1型NeV毒株的核苷酸相似性為83.5%～89.8%，氨基酸相似性為92.0%～95.1%；與僅有的3個基因1.2型NeV毒株的核苷酸相似性為86.5%～89.5%，氨基酸相似性為95.1%～97.8%；與16個基因1.3型NeV毒株的核苷酸相似性為84.4%～87.3%，氨基酸相似性為92.0%～94.4%；與14個基因1.4型NeV毒株的核苷酸相似性為79.9%～86.8%，氨基酸相似性為88.4%～95.1%。與2個基因2型NeV毒株的核苷酸相似性為69.3%～69.8%，氨基酸相似性為75.4%～76.7%。與2個基因3型NeV毒株的核苷酸相似性為71.6%～72.8%，氨基酸相似性為79.1%～80.7%。完整VP1氨基酸進化樹顯示，本研究的4個毒株與美國毒株TCG、CV519-OH和日本毒株OKY共同聚為一個獨立的分支，屬于基因1.2型(圖2)。

本研究的河南毒株與寧夏毒株相比，有21個共同的氨基酸突變，13個位于P2區(qū)(S280T、T/M288Q、A290V、N291E、I297M、T323V、E355G、N369S、D378 N、N383H、A404S、R416Q、E418D)，3個位于P1區(qū)(T219S、L229Q、G454A)，5個位于S區(qū)(H11Q、H12 N、A56T、I80V、N95H)。4個毒株與GenBank中僅有的3個基因1.2型毒株相比，有3個相同的氨基酸突變，1個位于P2區(qū)(D380E)，2個位于P1區(qū)(G453S和S477T)。與21條國內(nèi)基因1.1型毒株相比，有12個相同的氨基酸突變，9個位于P2區(qū)(H/C/R292V、V298A、G326E、G341S、T384A、L389V、R/S401Q、A/T/V402S和I420V)，2個位于P1區(qū)(T493 N和L523I)，1個位于S區(qū)(V/M/T154I)。與4條國內(nèi)基因1.3型毒株相比，有21個相同的氨基酸突變，18個位于P2區(qū)(E293 N、G294R、L311F、T322S、T325G、A326P、V332I、G341S、N342D、I353V、Y368F、A377I、T382V、V384T、Y398F、H401Q、A403T和I420V)，2個位于P1區(qū)(C268S和S476T)，1個位于S區(qū)(V154I)。與2條國內(nèi)1.4型毒株相比，有17個相同的氨基酸突變，14個位于P2區(qū)(E293 N、G294R、L311F、A322S、S325G、T326P、A327D、V332I、G341S、V350T、A377I、Q380E、T382V和Y398F)，2個位于P1區(qū)(C268S和S476T)，1個位于S區(qū)(V154I)。

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；1～5.VP1分段擴增結(jié)果M. DL2000 DNA marker；1-5.Amplification result of VP1 fragments圖1 VP1擴增電泳圖Fig.1 Electrophoregram of VP1 amplification

2.3 完整RdRp基因序列的分析

成功獲得4條NeV完整的RdRp序列，與VP1序列來自相同的樣本，擴增結(jié)果見圖3。RdRp長度均為1 455 bp，編碼485 aa。4個完整RdRp序列之間的核苷酸相似性為95.1%～100.0%，氨基酸相似性為99.4%～100.0%；與GenBank中5個完整NB-like毒株的核苷酸相似性為85.3%～94.8%，氨基酸相似性為95.9%～99.4%；與1個完整NA1-like毒株的核苷酸相似性為78.4%～78.7%，氨基酸相似性為89.7%～89.9%；與2個完整SC-yak毒株的核苷酸相似性為67.2%～67.8%，氨基酸相似性為75.1%～75.9%。完整RdRp核苷酸遺傳進化顯示，本研究的4個完整RdRp序列與國內(nèi)毒株Bo/LZB-1/17/CH和Bo/YLA-2/17/CH的遺傳關(guān)系最近，屬于NB-like型(圖4)。

對完整RdRp序列進行進一步分析，與其他3個NB-like型毒株相比，國內(nèi)6個NB-like型毒株(包括本研究的4株)有36個相同的核苷酸突變，其中28個為無義突變(G60A、A168G、G174A、C192T、C291A、C309T、G348A、G363A、A/G/C405T、G435A、A474G、T/A519G、A525G、G546A、C582T、A/G735C、A/C753C、A798G、T/G/C879A、C1002T、C1068T、T/A1116C、T1125C、A/G1158C、G1221A、T1227C、T1305A和T/C1317G)，8個為有義突變(G97A、C/T511A、G862A、A1036G、T1037C、T1228A、T1230C和T1421C)，這些有義突變導(dǎo)致了6個氨基酸突變(G33S、L171M、V288M、M346A、S410T和M474T)。

3 討 論

NeV是犢牛腹瀉的重要病原，在世界各地有廣泛的地域分布[11-16]。NeV是國內(nèi)犢牛腹瀉的新發(fā)病原，在新疆、陜西、河南、四川等地犢牛腹瀉糞便均有較高的檢出率，該病毒在我國的流行情況值得進一步被監(jiān)測。本研究首次在寧夏犢牛腹瀉糞便檢出NeV，檢出率為11.32%，為當(dāng)?shù)貭倥８篂a的診斷和防治提供了參考。本試驗在河南地區(qū)的檢出率低于前期對2017—2018年采集的河南樣本的檢出率，可能是由于采樣的時間和地點存在差異。此外，NeV既存在單獨感染，也存在混合感染，這與先前報道的結(jié)果相似[5]。

迄今為止，GenBank中共登錄了30條國內(nèi)NeVVP1序列(21條基因1.1型，4條基因1.3型，2條基因1.4型，1條基因2型，2條基因3型)，表明我國NeV VP1具有豐富的遺傳多樣性，但目前還未見基因1.2型毒株的報道。本試驗成功地從河南和寧夏地區(qū)各獲得了2條基因1.2型毒株的完整VP1序列，河南毒株與寧夏毒株在P2區(qū)有13個共同的氨基酸突變。前期研究顯示，與國外NeV毒株相比，國內(nèi)毒株有共同的進化趨勢，可能和地域環(huán)境有關(guān)[5]；本試驗結(jié)果提示，國內(nèi)不同地區(qū)的NeV毒株間VP1重要功能結(jié)構(gòu)域氨基酸也可能存在較大的差異。鑒于VP1 P2區(qū)含有受體結(jié)合位點和中和抗原表位，這些氨基酸突變的生物學(xué)意義值得進一步關(guān)注。盡管目前沒有關(guān)于NeV不同VP1基因型或基因亞型與HBGAs的結(jié)合能力差別的報道，但諾如病毒不同VP1基因型或亞型與HBGAs的結(jié)合存在差異[17-18]，從而導(dǎo)致不同基因型的流行程度不同。如：The Norwalk virus(GI.1型)能與H或A抗原結(jié)合[17]，VA207毒株(GⅡ.9型)能與Lex和Ley抗原結(jié)合[19]，而大流行GⅡ.4型毒株似乎能夠結(jié)合更廣譜的HBGAs，從而獲得更多的易感人群[18]。因此，NeV不同基因型或亞型的受體結(jié)合能力值得進一步研究。與國內(nèi)流行毒株基因1.1型毒株相比，本試驗獲得的4個基因1.2型毒株在P2區(qū)有12個共同的氨基酸突變，這些突變導(dǎo)致的抗原漂移可能引起病毒的免疫逃避現(xiàn)象[20]。

▲表示我國NeV毒株，■表示本研究的毒株▲ marks the NeV strains in China, ■ marks the strains in this study圖2 完整VP1氨基酸的最大似然法進化樹Fig.2 The maximum likelihood phylogenetic tree based on complete VP1 amino acids

M. DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準；A～D. RdRp分段擴增結(jié)果M. DL2000 DNA marker；A-D. Amplification result of RdRp fragments圖3 RdRp擴增電泳圖Fig.3 Electrophoregram of RdRp amplification

RdRp對杯狀病毒的復(fù)制起著重要作用，復(fù)制的保真度可能影響病毒的傳播能力[21-22]。例如，在諾如病毒中，大流行毒株GⅡ.4的RdRp具有較高的突變率，顯示出較低的復(fù)制保真度，表明RdRp的單點突變對病毒的復(fù)制和傳播產(chǎn)生了影響[22-23]，這種由RdRp驅(qū)動的遺傳多樣性對病毒的適應(yīng)性至關(guān)重要[21]。本試驗成功獲得了4個完整RdRp序列，使得GenBank中NeV完整RdRp序列由8個增加到12個。目前，NB-like型為主要的流行毒株，與GenBank中其他3個NB-like型毒株相比，國內(nèi)6個NB-like型RdRp序列(包括本研究的4株)共有36個相同的核苷酸突變，顯示國內(nèi)NeV毒株具有共同的進化趨勢。這種地域相關(guān)的RdRp進化現(xiàn)象也在韓國的NeV毒株中觀察到[12]。與NA1-like型毒株和SC-yak型毒株相比，NB-like型毒株在RdRp區(qū)分別有110個和222個核苷酸突變，并且大多數(shù)核苷酸為無義突變。盡管目前關(guān)于RdRp無義突變的生物學(xué)意義并不清楚，但RdRp是NeV的檢測靶基因，核苷酸突變會影響已有PCR檢測方法的檢出效果。因此監(jiān)測RdRp核苷酸序列的遺傳變異，驗證或調(diào)整NeV的PCR檢測方法，對保證檢測結(jié)果的準確性具有重要意義。

▲表示我國NeV毒株，■表示本研究的毒株▲ marks the NeV strains in China, ■ marks the strains in this study圖4 完整RdRp核苷酸的最大似然法進化樹Fig.4 The maximum likelihood phylogenetic tree based on complete RdRp nucleotide

4 結(jié) 論

本研究調(diào)查了2019年寧夏和河南地區(qū)NeV的流行情況，首次在我國檢測到VP1基因1.2型毒株并從4個樣本中同時獲得基因1.2型毒株的完整VP1和RdRp序列，為國內(nèi)NeV分子流行病學(xué)調(diào)查和遺傳進化研究等提供有用信息。