后海、后三里、大腸俞對大鼠便秘及胃腸運動神經遞質的影響

李 碩，王海燕，馬愛團

(河北農業大學中獸醫學院，保定 071000)

早在1979年12月，便秘就被列入世界衛生組織(WHO)推薦針灸治療的43種病癥之一。對于消化系統病譜，便秘是針灸治療的優勢病種[1]。便秘是獸醫臨床常見疾病，西藥主要通過刺激胃腸運動進行緩解，但長期使用效果不理想。針灸治療動物便秘取穴方便，療效確切。根據古籍記載和臨床經驗，后海(GV-1)能夠顯著緩解動物便秘，后三里(ST-36)和大腸俞(BL-25)廣泛治療人和動物的胃腸道疾病[2-4]。雖然臨床證實了這些穴位對便秘的治療效果，但獸醫針灸的基礎研究非常薄弱，目前，尚不明確不同穴位緩解便秘的作用途徑和作用機理是否一致，治療便秘的優勢穴位是哪個等。本試驗用洛哌丁胺建立大鼠便秘模型[5]，選擇臨床治療動物便秘常用的GV-1、ST-36、BL-25，研究3個穴位對便秘大鼠的緩解作用，檢測針灸對胃腸動力相關神經遞質的影響，比較結腸組織結構的完整性及變化，比較3個穴位的異同，探索治療便秘的優勢穴位，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物 選取SPF級SD大鼠60只[購自斯貝福(北京)生物科技有限公司]，體質量(210±10)g，在ivc鼠房單只單籠飼養，自由飲水飲食，室內溫度(21±2)℃，相對濕度(55±5)%。于墊料上放置濾網方便采集大鼠糞便和觀察糞便情況。

1.1.2 藥物 將鹽酸洛哌丁胺(2 mg·粒-1)(上海朝暉藥業有限公司)除去外面膠囊，將藥粉與蒸餾水混勻，制成混懸液備用。將枸櫞酸莫沙必利(5 mg·片-1)(魯南貝特有限公司)片劑壓成粉末，與蒸餾水混勻制成混懸液備用。

1.1.3 主要試劑與儀器 Go Taq?pCR Master Mix(A6001， Promega, USA)、GoScriptTMReverse Transcription System (A5001, Promega, USA)、Eastep?Super總RNA提取試劑盒 (LS1040, Promega，北京)、Rat VIP ELISA KIT、Rat SS ELISA KIT、Rat SP ELISA KIT、Rat 5-HT ELISA KIT (酶聯生物科技有限公司，上海)、冷凍離心機(Sigma公司)、SYNERGY HTX全波長酶標儀(Bio Tek公司)、LightCycler?96全自動熒光定量PCR儀(羅氏診斷產品有限公司，上海)等。

1.2 試驗方法

1.2.1 動物分組及處理 60只SD大鼠(210±10)g適應性常規飼養后，采用抽簽的方法隨機分為6組，即對照A組、模型B組、西藥治療C組、GV-1D組、ST-36 E組、BL-25 F組，每組10只，均單籠飼養。A組灌服生理鹽水，其他各組均灌服3 mg·(kg·d)-1洛哌丁胺混懸液，每天上午1次，建立便秘模型[5]。5 d后，糞便含水量下降，首粒黑便時間延長，確定造模成功。每天上午繼續洛哌丁胺灌胃，同時在下午進行不同治療，連續6 d。其中，C組灌服莫沙必利[1.38 mg·(kg·d)-1][6]，D、E、F組大鼠分別針刺GV-1、ST-36、BL-25 3個穴位。GV-1位于尾根與肛門之間的凹陷，直刺5 mm；ST-36雙側取穴，位于膝關節下方3寸(體寸)，脛骨前嵴外側0.5寸(體寸)，直刺6 mm；BL-25雙側取穴，位于背中線旁開1.5寸(體寸)，第4腰椎兩側，直刺5 mm。穴位定位及針刺操作參照羅永江等[7]及Xie等[2]的方法，采用Mac脈針灸針(0.16 mm×7 mm)快速直刺入穴位，每10 min進行1次捻轉提插行針，留針30 min。 A組、B組和C組在大腿內側的非穴位處針刺30 min。第7天心臟采血，根據美國獸醫協會推出的動物安樂死指南頸椎脫臼安樂死。血液室溫靜置3 h，4 ℃ 3 500 r·min-1離心15 min，分離血清，分裝后置于超低溫冰箱保存備用。摘取結腸前段,置于4%甲醛溶液固定和超低溫冰箱保存備用。本研究經河北省動物保護協會批準，動物處理過程通過河北農業大學實驗動物管理使用委員會的動物倫理學審查。

1.2.2 各組大鼠便秘情況評定 禁食不禁水，動物試驗處理后再用0.3 mL墨水灌胃，記錄首粒黑便時間。觀察記錄大鼠20粒糞便長度、糞便含水量、體質量。

糞便含水量：收集糞便稱取濕質量，烘干箱90 ℃烘干6 h，稱取干質量：[糞便含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%]

1.2.3 指標檢測 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測5-羥色胺(5-HT)、生長抑素(SS)、血管活性腸肽(VIP)、P物質(SP)含量。采用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測結腸組織5-羥色胺3受體(5-HT3R)mRNA、5-羥色胺4受體(5-HT4R)mRNA相對表達量。結腸組織HE染色，觀察腸道組織結構，計數各組隱窩-絨毛軸中杯狀細胞數量。

表1 實時定量 PCR引物列表

1.2.4 數據統計 本試驗所有結果均表示為“平均值±標準差”。試驗過程中使用Excel數據庫記錄數據，并使用SPSS20.0分析軟件(IBM Corporation，Armonk，NY，USA)對試驗數據進行統計分析。方差齊性檢驗后，通過單因素方差分析(one way ANOVA)比較參數的差異性。LSD法進行組間多重比較。差異的顯著性水平為P<0.05或P<0.01。

2 結 果

2.1 GV-1、ST-36、BL-25 對大鼠便秘指標的影響

模型組大鼠首粒黑便時間延長，糞便含水量下降，糞便顆粒長度縮短，體重下降(P<0.01或P<0.05)。治療后GV-1組、ST-36組的首粒黑便時間縮短 (P<0.01)，與西藥治療組無顯著差異，接近對照組。與模型組比較，GV-1組、ST-36組、BL-25組糞便含水量分別增加12.86%、16.67%、14.59% (P<0.01)。GV-1組20粒糞便長度與模型組有極顯著差別，并且優于西藥治療組。GV-1組和ST-36組大鼠體重比模型組顯著增加 (P<0.05)，詳見表2和圖1。

2.2 GV-1、ST-36、BL-25 對便秘大鼠胃腸運動相關神經遞質的影響

由圖2可知，模型組大鼠血清5-HT含量升高(P<0.01)，針刺ST-36使血清中5-HT含量降低23.93%，與模型組有極顯著性差異；GV-1和BL-25分別降低5.41%和7.47%，與模型組也有顯著性差異(P<0.05)。模型組血清SS含量極顯著上調(P<0.01)。針刺GV-1使SS含量降低36.34%，具有極顯著差異，基本達到對照組水平。針刺ST-36 使SS含量下調13.46% (P<0.05)。模型組血清VIP含量顯著降低，BL-25組VIP含量極顯著升高27.48%(P<0.01)，達到對照組水平。模型組血清SP含量顯著降低(P<0.05)，BL-25組SP含量顯著升高22.75% (P<0.05)。

表2 GV-1、ST-36、BL-25 對大鼠便秘指標的影響

A組. 對照；B組. 模型；C組. 西藥治療；D組. GV-1；E組. ST-36；F組. BL-25Group A. Control; Group B. Model; Group C. Western medicine treatment; Group D. GV-1; Group E. ST-36; Group F. BL-25圖1 GV-1、ST-36、BL-25對便秘大鼠20粒糞便顆粒長度的影響Fig.1 Effect of GV-1, ST-36, BL-25 on the length of 20 fecal pellets in rats with constipation

2.3 GV-1、ST-36、BL-25 對大鼠結腸組織結構的影響

對照組大鼠結腸組織結構清晰完整，腸腺發達，黏膜上皮細胞連接緊密，固有層無炎癥或萎縮，有大量杯狀細胞，杯狀細胞在進行HE染色時，黏原顆粒被染料溶解，多呈現出空泡狀[8]。模型組大鼠結腸組織結構模糊，腸腺萎縮、腫脹，黏膜上皮缺失，杯狀細胞減少。GV-1組結腸組織結構清晰，腸腺恢復正常，杯狀細胞變大、增多。ST-36 和BL-25 組較模型組黏膜上皮完整，腸腺增寬。此外，GV-1 組結腸隱窩-絨毛軸中的杯狀細胞數量(418.60±12.0)個，與模型組(381.80±8.62)個比較，差異顯著(P<0.01)， 優于西藥治療組，ST-36、BL-25組杯狀細胞數量也有顯著增加(數據略)，達到西藥治療組水平。

圖2 GV-1、ST-36、BL-25對便秘大鼠神經遞質的影響Fig.2 The effect of GV-1, ST-36, BL-25 on neurotransmitters in constipation rats

→表示絨毛杯狀細胞→refers to villous goblet cells圖3 GV-1、ST-36、BL-25對大鼠結腸組織結構的影響(400×)Fig.3 Effects of GV-1, ST-36, BL-25 on the tissue structure of rat colon (400×)

2.4 GV-1、ST-36、BL-25 對便秘大鼠結腸組織中5-HT3R、5-HT4R mRNA的影響

由圖4可知，與對照組比較，模型組結腸組織中5-HT3R mRNA相對表達量降低67.96% (P<0.01)。而針刺GV-1、ST-36，5-HT3R mRNA相對表達量比模型組分別增加36.07%、40.98% (P<0.05)，與西藥組無差異。模型組結腸組織中5-HT4R mRNA相對表達量降低42%(P<0.01)。而ST-36組5-HT4RmRNA相對表達量比模型組增加65.52%(P<0.01)，優于西藥治療組。GV-1組、BL-25組5-HT4RmRNA相對表達量分別增加32.76%、37.93%，差異顯著(P<0.05)。

圖4 GV-1、ST-36、BL-25對便秘大鼠結腸組織中5-HT3R、5-HT4R mRNA相對表達量的影響Fig.4 The effect of GV-1, ST-36, BL-25 on the relative expression of 5-HT3R and 5-HT4R mRNA in the colon tissue of constipated rats

3 討 論

獸醫針灸是我國優秀的文化遺產，由于獸醫針灸的基礎研究相對滯后，嚴重影響其在動物臨床上的應用。消化系統疾病是獸醫臨床常見病，針灸治療快速有效，GV-1、ST-36和BL-25是治療便秘及其他消化系統疾病的代表穴位[2.9]。

后海(GV-1)為督脈之始穴，動物的后海取穴方便，效果迅速，多用于腹瀉、便秘及其他胃腸道疾病的治療[2.9]。本試驗表明，針刺GV-1能夠降低血清中SS含量。SS作為腸道抑制性神經遞質，當胃腸道中SS的含量高于正常水平時, 則會使腸蠕動變緩，分泌異常[10]。GV-1還可以降低血清中5-HT濃度，5-HT表達水平過高會產生興奮性毒性[11]，導致結腸部位環形肌收縮和舒張功能異常[12]。由于5-HT濃度的升高，結腸持續處于收縮狀態，與糞便結合更緊密，過多吸收糞便中水分，導致糞便中水分減少引起便秘。針刺GV-1后下調了5-HT血清中的含量，緩解洛哌丁胺造成結腸環形肌收縮和舒張功能異常[13]，加快糞便通過結腸時間從而緩解便秘癥狀。

后三里(ST-36)是治療各種消化系統疾病的重要穴位，其療效已經過千百年的驗證。研究表明，針刺ST-36可以上調結腸組織5-HT3R、5-HT4R mRNA相對表達量。5-HT3R屬于配體門控陽離子通道受體[14]，5-HT3R可以影響細胞內Ca2+濃度增加間質細胞的活性，從而提高胃腸道的運動能力。據報道，5-HT3R拮抗劑能抑制結腸蠕動，減少消化液分泌，導致便秘發生[15-16]。5-HT4R能增強腸道平滑肌收縮，增加腸道分泌。推測5-HT3R 與5-HT結合增加細胞內Ca2+濃度并刺激中樞和外周神經元的興奮性，促進神經遞質的釋放，增加乙酰膽堿(ACH)含量[17]。5-HT 作用于腸道 5-HT4R，促進 ACH 分泌，增加腸道平滑肌收縮頻率，增強腸道平滑肌蠕動，影響腸蠕動和分泌，縮短在結腸的時間及水分重吸收[18]。ST-36還可以下調SS緩解便秘癥狀。

大腸俞(BL-25)是大腸背俞穴，廣泛治療便秘及其他腸道疾病。本試驗表明，針刺BL-25可以提高血清中VIP和SP含量。研究證實，VIP能夠改變消化道運動功能，改善便秘癥狀[19]，或者通過VIP-cAMP-PKA-AQP3通路治療功能性便秘[20]。VIP可使內臟血管、胃腸道平滑肌舒張，增加膽汁、小腸水電解質的分泌[21]，同時具有正性肌力的作用[22]。SP是體內最強的興奮平滑肌的物質之一，可直接作用于腸道平滑肌[23]，使平滑肌收縮、蠕動增強，促進腸道排空，從而緩解便秘癥狀。

另外，針刺GV-1、ST-36、BL-25均可增加結腸杯狀細胞的數量，研究表明，結腸杯狀細胞分泌黏蛋白，是結腸黏液層的重要成分[24]。杯狀細胞分泌的黏蛋白伴隨水分的擴散分泌進入腸腔，增加腸腔內水分，緩解便秘。

4 結 論

針刺GV-1、ST-36、BL-25穴位均能改善便秘癥狀。GV-1可顯著降低血清中5-HT、SS含量，上調結腸組織中5-HT3R、5-HT4R mRNA表達。ST-36降低血清中5-HT含量，提高結腸組織中5-HT3R、5-HT4R mRNA表達。BL-25提高血清中VIP、SP含量，增加5-HT4R mRNA表達。3個穴位均能改善便秘大鼠結腸組織結構，增加杯狀細胞數量。綜上表明，GV-1治療便秘效果優于ST-36和BL-25。