lncRNA-CCAT1通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬的影響

李沫宓 淑芳 王孝信（北華大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林132011）

宮頸癌是全球最常見的女性惡性腫瘤之一，五年生存率較低［1］，嚴(yán)重威脅著女性健康。因而，尋找宮頸癌治療和預(yù)后的新方法對(duì)提高宮頸癌的診治水平具有重大意義。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（colon cancer associated transcript-1，CCAT1）一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中占有重要地位，可參與調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能。已有研究顯示，lncRNA-CCAT1在宮頸癌組織中高表達(dá)，與患者腫瘤分期、腫瘤大小及預(yù)后相關(guān)，并且CCAT1可以促進(jìn)宮頸癌HeLa和CaSki細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并抑制其凋亡［2-3］。眾所周知，自噬是腫瘤進(jìn)展中的一個(gè)重要過程，然而CCAT1是否對(duì)宮頸癌自噬有調(diào)控作用目前尚不清楚。多項(xiàng)研究顯示，CCAT1能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路，而PI3K/Akt信號(hào)通路可進(jìn)一步激活mTOR并抑制自噬的形成［4-6］。故推測(cè)CCAT1過表達(dá)可能通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞自噬。因此，本研究擬通過向?qū)m頸癌HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CCAT1過 表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-CCAT1），探討CCAT1過表達(dá)對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬的影響，并初步闡明其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCAT1過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-CCAT1及其空載對(duì)照組質(zhì)粒pcDNA3.1-vector均由漢恒生物科技（上海）有限公司構(gòu)建；PI3K特異性抑制劑LY294002購(gòu) 自 美 國(guó)MedChemExpress公 司；Lipo?fectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol RNA分離試劑均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；CCK8檢測(cè)試劑盒、單丹磺酰戊二酸（MDC）染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；Beclin1抗體、p62抗體、LC3抗體、p-PI3K抗體、PI3K抗體、p-Akt抗體、Akt抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體和GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司；PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，細(xì)胞復(fù)蘇后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每2~3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HeLa細(xì)胞，用胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)/孔的細(xì)胞接種量將細(xì)胞接種于6孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（Blank，不做任何處理）、空載對(duì)照組（Vector，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-vector質(zhì)粒）和CCAT1過表達(dá)組（pcD?NA3.1-CCAT1，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CCAT1質(zhì)粒）。待細(xì)胞融合度達(dá)到約85%時(shí)，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將pcDNA3.1-vector質(zhì)粒和pcD?NA3.1-CCAT1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，采用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中CCAT1表達(dá)水平以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中CCAT1表達(dá)水平收集各組轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞，采用TRIzol法提取各樣本的總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。取3μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列：CCAT1 For?ward 5'-TTTATGCTTGAGCCTTGA-3'，Reverse 5'-CTTGCCTGAAATACTTGC-3'；GAPDH Forward 5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，Reverse 5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性60 s，92℃變性30 s，58℃退火15 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算CCAT1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性取對(duì)數(shù)期各組轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞，以4×103個(gè)/孔的細(xì)胞接種量重新接種于96孔板，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)12 h、24 h和48 h后，每孔加入20 μl CCK8溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各組在490 nm處的吸光度值（OD），取均值表示各組細(xì)胞增殖活性。1.2.4 MDC染色取對(duì)數(shù)期各組轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔的細(xì)胞接種量接種于內(nèi)置有無(wú)菌玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)液，1×PBS洗滌3次，加入0.05 mmol/L MDC染色液覆蓋皿底，37℃避光染色15 min，1×PBS洗滌3次，取出玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡下拍照觀察，其中激發(fā)濾光片波長(zhǎng)355 nm，阻斷濾光片波長(zhǎng)512 nm，以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀染色為陽(yáng)性表現(xiàn)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平收集各組轉(zhuǎn)染后HeLa細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液于冰上裂解，4℃、12 000 r/min離心20 min，取上清液，采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取25 μg蛋白經(jīng)沸水浴變性后，用10% SDS-PAGE分離蛋白并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，加入一抗Beclin1（1∶1 000）、p62（1∶1 000）、LC3（1∶2 000）、p-PI3K（1∶500）、PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶2 000）、p-mTOR（1∶500）、mTOR（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育膜過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠二抗于室溫封閉1 h，ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光顯影，化學(xué)發(fā)光儀采集圖像，Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.2.6 PI3K特異性抑制劑LY294002處理細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求將細(xì)胞分空白對(duì)照組（Blank，不做任何處理）、CCAT1過表達(dá)組（pcD?NA3.1-CCAT1，轉(zhuǎn) 染pcDNA3.1-CCAT1質(zhì) 粒）、LY294002組（LY294002，采用10 mmol/L LY294002處理24 h）和聯(lián)合處理組（pcDNA3.1-CCAT1+LY294002，在CCAT1過表達(dá)組的基礎(chǔ)上再經(jīng)10 mmol/L LY294002處理24 h），處理結(jié)束后收集各組細(xì)胞，采用上述Western blot法檢測(cè)自噬和PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCAT1過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞中CCAT1表達(dá)水平的影響RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，與Blank和Vector組比較，pcDNA3.1-CCAT1組細(xì)胞中CCAT1表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），提示pcD?NA3.1-CCAT1轉(zhuǎn)染成功。

圖1 HeLa細(xì)胞中CCAT1表達(dá)水平比較Fig.1 Expression level of CCAT1 in HeLa cells

2.2 CCAT1過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活性的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Blank和Vector組比較，pcD?NA3.1-CCAT1組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h和48 h時(shí)其增殖活性顯著增強(qiáng)（P<0.05），如圖2所示。

圖2 CCAT1過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞增殖活性的影響Fig.2 Effect of CCAT1 overexpression on proliferation activity of HeLa cells

2.3 CCAT1過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響

MDC染色結(jié)果顯示，與Blank和Vector組比較，pcD?NA3.1-CCAT1組細(xì)胞內(nèi)紫色點(diǎn)狀熒光亮度明顯減弱，如圖3所示。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Blank和Vector組比較，pcDNA3.1-CCAT1組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），而p62蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），如圖4所示。

圖3 MDC染色（×400）Fig.3 MDC staining（×400）

圖4 CCAT1過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of CCAT1 overexpression on expression of autophagy-related proteins in HeLa cells

2.4 CCAT1過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Blank和Vector組比較，pcDNA3.1-CCAT1組細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR等水平顯著升高（P<0.05，圖5），而PI3K、Akt和mTOR蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性變化（P>0.05）。

圖5 CCAT1過表達(dá)對(duì)HeLa細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of CCAT1 overexpression on expression of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway proteins in HeLa cells

2.5 聯(lián)合干預(yù)對(duì)HeLa細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，與Blank組比較，pcDNA3.1-CCAT1組細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），p62蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），而LY294002組細(xì)胞

圖6 LY294002對(duì)HeLa細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of LY294002 on expression of autophagy-re?lated proteins in HeLa cells

中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），p62蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與pcDNA3.1-CCAT1組比較，pcDNA3.1-CCAT1+LY294002細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），p62蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。

2.6 聯(lián)合干預(yù)對(duì)HeLa細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的影響Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖7）顯示，與Blank組 比較，pcDNA3.1-CCAT1組細(xì) 胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），LY294002組細(xì)胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與pcDNA3.1-CCAT1組比較，pcDNA3.1-CCAT1+LY294002細(xì)胞中p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著減少（P<0.05）。

圖7 LY294002對(duì)HeLa細(xì)胞p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of LY294002 on p-Akt and p-mTOR pro?tein expression in HeLa cells

3 討論

越來越多的研究表明，lncRNAs在包括宮頸癌在內(nèi)的各種腫瘤生物學(xué)進(jìn)程中起關(guān)鍵作用［7］。ZHANG等［8］發(fā)現(xiàn)，CCAT1在宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡；同時(shí)也有研究表明，沉默CCAT1能抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖和遷移，最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡［9］。自噬是在應(yīng)激條件下參與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種分解代謝過程，可影響腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移、增殖、能量代謝以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞存活與死亡等多個(gè)方面，通過藥物或其他途徑使腫瘤細(xì)胞過度自噬，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬依賴性死亡，正在成為腫瘤治療的新策略［10］。眾多研究顯示，CCAT1可以通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制細(xì)胞自噬［4-6］。但也有研究顯示，CCAT1過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬，這可能是由于腫瘤的異質(zhì)性所致［11］。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)CCAT1能夠通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬。

自噬的發(fā)生與發(fā)展需要很多基因和蛋白質(zhì)參與，多種自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和自噬相關(guān)信號(hào)的通路活性正在越來越多地被用于宮頸癌的病程和預(yù)后分析。Beclin1、LC3和p62都是檢測(cè)自噬活性的標(biāo)志性蛋白。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，Beclin1會(huì)通過調(diào)控其他自噬蛋白定位到前自噬小體膜上來控制自噬小體的形成［12］。細(xì)胞自噬過程中，細(xì)胞內(nèi)的LC3-Ⅰ被加工轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，并聚集在自噬體膜上，隨著自噬過程中自噬體的形成增多，LC3-Ⅰ型蛋白向LC3-Ⅱ型蛋白轉(zhuǎn)換增加，因此可以通過檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ來衡量細(xì)胞的自噬活性，而自噬底物蛋白p62參與自噬體的降解過程，其表達(dá)量增加可抑制細(xì)胞自噬［13-14］。GUO等［11］研究顯示，CCAT1誘導(dǎo)肝癌HCC細(xì)胞自噬的同時(shí)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，并抑制p62的表達(dá)；SU等［4］對(duì)足突細(xì)胞的研究結(jié)果顯示，CCAT1過表達(dá)可以通過抑制細(xì)胞自噬減少細(xì)胞凋亡，并伴隨著細(xì)胞內(nèi)p62蛋白表達(dá)水平上調(diào)以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低。為了研究CCAT1在宮頸癌細(xì)胞中是否具有作用，本實(shí)驗(yàn)首先采CCAT1過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1-CCAT1）轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞增殖能力顯著上調(diào)，MDC染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡聚集較對(duì)照組和陰性轉(zhuǎn)染組明顯減少。同時(shí)，Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCAT1過表達(dá)可以降低HeLa細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ以及下調(diào)Beclin1蛋白表達(dá)水平，并促進(jìn)p62蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)過表達(dá)CCAT1可以抑制HeLa細(xì)胞自噬活性。

自噬受多條信號(hào)通路調(diào)控，其中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是研究最為廣泛的信號(hào)通路之一，其核心蛋白mTOR的活化是決定自噬體形成和成熟的關(guān)鍵蛋白。有研究報(bào)道，PI3K/Akt信號(hào)通路激活后，會(huì)進(jìn)一步激活下游mTOR的功能，從而發(fā)揮細(xì)胞自噬的抑制作用［15-18］。為了進(jìn)一步探討過表達(dá)CCAT1抑制HeLa細(xì)胞自噬的可能分子機(jī)制，本文研究了過表達(dá)CCAT1對(duì)p-Akt、Akt、p-PI3K、PI3K、p-mTOR和mTOR表達(dá)的影響，并觀察PI3K特異性抑制劑LY294002對(duì)HeLa細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果顯示，CCAT1過表達(dá)可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)，而采用LY294002干預(yù)會(huì)抑制相關(guān)通路蛋白的表達(dá)，但pcDNA3.1-CCAT1和LY294002聯(lián)合干預(yù)可以逆轉(zhuǎn)LY294002對(duì)相關(guān)蛋白的抑制作用，表明過表達(dá)CCAT1可以通過激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的磷酸化抑制HeLa細(xì)胞的自噬。

綜上所述，本文初步探究了CCAT1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬的影響，發(fā)現(xiàn)CCAT1對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞的作用機(jī)制與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活有關(guān)，該研究有望為以自噬為靶標(biāo)的宮頸癌生物治療研究和藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。