沉默TRIM31基因表達(dá)通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移與侵襲①

徐兵 李勇 劉明 劉永輝（南華大學(xué)附屬第三醫(yī)院泌尿外科，衡陽(yáng)421900）

膀胱癌是一種泌尿系統(tǒng)腫瘤，位居全球男性最常見(jiàn)癌癥的第7位，四分之三的病例發(fā)生于男性，但近年來(lái)，其在女性中的發(fā)病率和死亡率也呈明顯上升趨勢(shì)［1-2］。膀胱癌具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)特點(diǎn)，轉(zhuǎn)移性膀胱癌一直以來(lái)都是臨床上難以解決的問(wèn)題，死亡率較高［3］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchy?mal transition，EMT）是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性過(guò)程，在膀胱癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［4］。因此，調(diào)控EMT，抑制膀胱癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，將為膀胱癌的治療提供更多可能。三結(jié)構(gòu)域蛋白31（tripar?tite motif containing 31，TRIM31）是含trip基因序列蛋白家族的一員，具有E3泛素連接酶活性，廣泛參與機(jī)體生物學(xué)和病理過(guò)程。TRIM31在多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，且過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性行為，增強(qiáng)腫瘤的侵襲能力［5-6］。蔡坤等［7］發(fā)現(xiàn)，沉默胰腺癌細(xì)胞中TRIM31的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。有研究顯示，TRIM31是正常人與膀胱癌患者間的差異表達(dá)基因之一，在膀胱癌中呈高表達(dá)［8］。但關(guān)于TRIM31在膀胱癌中的作用，對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移、侵襲及EMT的影響卻鮮有報(bào)道，故本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，觀察沉默TRIM31基因表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，并初步闡明其作用機(jī)制，以期為臨床靶向治療膀胱癌提供更多理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人膀胱癌細(xì)胞系5637和T24均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Lipofectamine?NAiMAX、TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)KAPA Biosystems公司；Matri?gel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；小鼠抗人TRIM31多克隆抗體、兔抗人β-連環(huán)蛋白（β-catenin）多克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）多克隆抗體、兔抗人MMP-9多克隆抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin）多克隆抗體、兔抗人上皮鈣依賴(lài)黏附蛋白（E-cadherin）單克隆抗體、兔抗人Snail1多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、山羊抗兔IgG抗體和山羊抗小鼠IgG抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；化學(xué)發(fā)光試劑、PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Milli?pore公司；TRIM31 siRNA和陰性對(duì)照片段（NC）由北京華大基因設(shè)計(jì)合成；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；熒光定量PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Transwell培養(yǎng)小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染從液氮罐中取出人膀胱癌5637和T24細(xì)胞，37℃水浴融化凍存液，1 000 r/min離心3 min，棄上清，加入1 ml DMEM重懸細(xì)胞沉淀。轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再加入4 ml含10%胎牛血清的新鮮DMEM，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5637和T24細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔分別接種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，將細(xì)胞分為對(duì)照組、siRNA-NC組和siRNATRIM31組，采用Lipofectamine?RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑將TRIM31 siRNA和NC分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞沉淀檢測(cè)TRIM31 mRNA和蛋白表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中TRIM31 mRNA表達(dá)水平取各組細(xì)胞沉淀，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，利用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。反應(yīng)條件：94℃2 min；98℃變性10 s，54℃退火15 s，68℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃7 min。以下為引物序列，TRIM31 F：5'-GTCTTGTGCAGAAGTGAAGAGTT-3'，R：5'-TCACAAAACCAAGCCCGGAT-3'；GAPDH F：5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'，R：5'-AGTAC-TTGCGCTCAGGAGGA-3'。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-??Ct方法計(jì)算TRIM31 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲消化轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用不含血清的DMEM饑餓處理12 h。制作單細(xì)胞懸液，稀釋至濃度為1×105個(gè)/ml，接種于Transwell小室，每小室含0.5 ml細(xì)胞懸液，下層24孔板中加入0.75 ml含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入1 ml 4%甲醛固定10 min，再加入1 ml 0.5%結(jié)晶紫溶液染色30 min。PBS洗滌3次，室溫晾干，擦去Transwell小室中沒(méi)有遷移的細(xì)胞，于顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野觀察細(xì)胞遷移情況并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，需在Transwell小室上室底部鋪設(shè)Matrigel膠，其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)一致。

1.2.4 免疫熒光染色觀察β-catenin蛋白核轉(zhuǎn)位水平用胰酶消化各組細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板（孔內(nèi)加入玻片），置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗后，加入0.5%Triton X-100通透20 min，加入5%封閉液封閉1 h。PBS清洗，加入兔抗β-catenin抗體稀釋液（1∶500），37℃孵育1 h。PBS洗滌3次，加入經(jīng)熒光標(biāo)記的二抗稀釋液，37℃孵 育30 min，PBS洗滌3次，滴加DAPI避光孵 育10 min，PBS洗滌3次，再滴加抗熒光淬滅封片液，取一塊干凈的載玻片，吸取多余的液體，細(xì)胞面朝下貼于載玻片上，顯微鏡觀察染色情況。

1.2.5 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平取各組細(xì)胞沉淀，采用RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白，經(jīng)BCA法測(cè)蛋白濃度后，取20μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，37℃封閉1 h。加入一抗稀釋液TRIM31（1∶1 000）、β-catenin（1∶1 000）、MMP-2（1∶2 000）、MMP-9（1∶1 000）、Vimentin（1∶2 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Snail1（1∶500）和GAPDH（1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。PBS清洗3次，加入二抗稀釋液［經(jīng)HRP標(biāo)記的IgG（1∶10 000）］，室溫孵育1 h，PBS清洗3次。加入化學(xué)發(fā)光試劑，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光顯影，分析各蛋白條帶灰度值，計(jì)算蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 siRNA沉默膀胱癌細(xì)胞中TRIM31基因表達(dá)

qRT-PCR（圖1A）和Western blot（圖1B）檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，siRNA-NC組T24細(xì)胞和5637細(xì)胞中的TRIM31mRNA及蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與siRNA-NC組相比，siRNATRIM31組T24細(xì)胞和5637細(xì)胞中的TRIM31mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低（P<0.01），證實(shí)本研究成功獲得TRIM31基因沉默的膀胱癌細(xì)胞株。

圖1 TRIM31基因沉默對(duì)T24和5637細(xì)胞中TRIM31 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of silencing TRIM31 gene on mRNA and pro?tein expressions of TRIM31 in T24 and 5637 cells

2.2 沉默TRIM31基因?qū)Π螂装┘?xì)胞遷移與侵襲的影響Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，siRNA-NC組T24和5637細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM31組T24和5637細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P<0.01，圖2、3）。Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，siRNA-NC組T24和5637細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與siRNA-NC組相比，siRNA-TRIM31組T24和5637細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.01，圖4）。

圖2 TRIM31基因沉默對(duì)T24和5637細(xì)胞的遷移的影響（×200）Fig.2 Effect of silencing TRIM31 gene on migration of T24 and 5637 cells（×200）

圖4 TRIM31基因沉默對(duì)T24和5637細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of silencing TRIM31 gene on protein expres?sions of MMP-2 and MMP-9 in T24 and 5637 cells

2.3 沉默TRIM31基因?qū)Π螂装┘?xì)胞β-catenin蛋白核轉(zhuǎn)位的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示，對(duì)照組和siRNA-NC組T24和5637細(xì)胞中β-catenin蛋白熒光在細(xì)胞核中高密度聚集，在細(xì)胞質(zhì)中也有大量表達(dá)；而siRNA-TRIM31組T24和5637細(xì)胞中β-catenin蛋白熒光在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均較弱（圖5）。

圖3 TRIM31基因沉默對(duì)T24和5637細(xì)胞的侵襲的影響（×200）Fig.3 Effect of silencing TRIM31 gene on invasion of T24 and 5637 cells（×200）

圖5 免疫熒光染色觀察T24和5637細(xì)胞中β-catenin蛋白定位（×400）Fig.5 Location of β-catenin protein in T24 and 5637 cells was observed by immunofluorescence（×400）

2.4 沉默TRIM31基因?qū)Π螂装┘?xì)胞EMT相關(guān)蛋白及Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，siRNA-NC組T24和5637細(xì)胞中βcatenin、Snail1、Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與siRNA-NC組相比，siR?NA-TRIM31組T24和5637細(xì)胞中β-catenin、Snail1和Vimentin蛋白表達(dá)水平降低（P<0.01），而E-cad?herin蛋白表達(dá)水平升高（P<0.01，圖6）。

圖6 Western blot檢 測(cè)T24和5637細(xì) 胞 中β-catenin、Snail1、Vimentin和E-cadherin蛋白表達(dá)水平Fig.6 Expressions of β-catenin，Snail1，Vimentin and Ecadherin in T24 and 5637 cells were detected by Western blot

3 討論

EMT發(fā)生在多種生理和病理?xiàng)l件下，由一組保守的誘導(dǎo)信號(hào)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子和下游效應(yīng)器驅(qū)動(dòng)而成［9］。良性腫瘤向侵襲性增強(qiáng)表型進(jìn)展的過(guò)程很大程度依賴(lài)于EMT的激活，調(diào)控EMT過(guò)程對(duì)腫瘤的治療及控制轉(zhuǎn)移具有重要作用［9-10］。膀胱癌是男性最常見(jiàn)的癌癥之一，抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT成為治療膀胱癌的新策略之一［11］。EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白包括E-cadherin、Vimentin和Snail1等［12］。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)上皮質(zhì)性標(biāo)志物（E-cadherin），下調(diào)間質(zhì)性標(biāo)志物（Vimentin）可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力［13］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，多種信號(hào)通路可通過(guò)誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)錄因子（如Snail1）的表達(dá)而觸發(fā)EMT，最終促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥，當(dāng)Snail1表達(dá)被抑制后則無(wú)法執(zhí)行下游的信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)控EMT過(guò)程［14］。SALEHI等［15］認(rèn)為Snail1在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可作為浸潤(rùn)性膀胱癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)，當(dāng)沉默膀胱癌細(xì)胞中Snail1表達(dá)時(shí)，Vimentin、MMPs均表達(dá)下調(diào)，E-cadherin表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞遷移能力減弱。本實(shí)驗(yàn)中Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)下調(diào)膀胱癌T24和5637細(xì)胞中TRIM31表達(dá)時(shí)，發(fā)生遷移與侵襲的T24細(xì)胞和5637細(xì)胞數(shù)量均明顯少于對(duì)照組和空載組，說(shuō)明沉默TRIM31表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。進(jìn)一步檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組或空載組相比，TRIM31干擾組T24細(xì)胞和5637細(xì)胞中Vimentin與Snail1蛋白表達(dá)水平明顯降低，E-cadherin表達(dá)水平明顯升高，提示沉默膀胱癌細(xì)胞中TRIM31表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程，從而影響膀胱癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路可作為誘發(fā)EMT的因素之一，是EMT過(guò)程中重要的信號(hào)通路之一，抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的EMT，進(jìn)而降低腫瘤的侵襲性［16-17］。β-catenin是介導(dǎo)細(xì)胞膜到細(xì)胞核間信號(hào)傳導(dǎo)的中心分子，當(dāng)βcatenin從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核時(shí)，激活下游靶基因（Snail1、MMP-2、MMP-9等）。ZHANG等［18］研究結(jié)果顯示，沉默膀胱癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，可通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)EMT，進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。SHI等［19］研究也發(fā)現(xiàn)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路后，MMP-2和MMP-9表達(dá)降低，影響EMT的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除TRIM31基因可抑制急性髓系白血病細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和耐藥性［20］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究發(fā)現(xiàn)基本一致，TRIM31基因在膀胱癌細(xì)胞中亦可調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，當(dāng)沉默T24細(xì)胞和5637細(xì)胞中TRIM31基因的表達(dá)，β-catenin表達(dá)減少，下游靶基因Snail1、MMP-2和MMP-9的表達(dá)也明顯減少。本研究結(jié)果提示，抑制膀胱癌細(xì)胞中TRIM31基因的表達(dá)可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及下游靶基因的表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)控膀胱癌細(xì)胞EMT。

綜上所述，沉默TRIM31可抑制膀胱癌細(xì)胞的遷移與侵襲，其作用機(jī)制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制膀胱癌細(xì)胞的EMT過(guò)程有關(guān)，推測(cè)TRIM31可能是膀胱癌治療的潛在靶點(diǎn)。本研究結(jié)果為膀胱癌靶向治療奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，后續(xù)還將進(jìn)一步從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。