基于AhR信號通路探討PM2.5暴露及BV治療對小鼠氣道炎癥的作用及機制

陳子琦 沈暘 胡國華 柯霞洪 蘇玲 康厚墉

（重慶醫科大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科，重慶400016）

顆粒物（PM）是我國現代社會最嚴重的環境問題之一［1］。PM2.5是指空氣動力學直徑≤2.5μm的細顆粒物，是中國空氣污染的主要成分，且平均濃度具有空間自相關性［2-3］。PM2.5表面可吸附各種有毒物質，進入呼吸道后主要沉積于氣管支氣管區域，對人體各器官造成不同程度損傷。PM2.5的致毒性是顆粒物和吸附的有毒污染物的綜合作用，如生物成分（內毒素、花粉、真菌孢子、病毒和細菌）、顆粒物、多環芳烴（PAHs）、揮發性有機化合物（VOCs）和重金屬［4］。大量研究顯示，PM2.5暴露與多種呼吸系統、循環系統及代謝系統疾病有關，如氣道過敏性疾病、急性呼吸道感染、哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、糖代謝異常、血壓異常等［5-7］。國內一項研究證明，低濃度PM2.5暴露可增加65歲及以上老年人死亡風險［8］。OGINO等［9］研究表明，PM2.5可誘導小鼠哮喘樣氣道炎癥，鼻內滴注PM2.5懸液可誘導小鼠氣道炎癥反應。此外，WANG等［10］研 究 發 現，PM2.5短 期 暴 露 可 誘 導BALB/c小鼠急性呼吸道炎癥。

芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）屬于堿性螺旋-環-螺旋超家族中的PAS亞家族，是配體依賴的多功能轉錄因子，參與細胞內外環境變化檢測，感知生物節律變化和氧化還原電位，在正常細胞發育和免疫調節中發揮作用［11］。AhR配體（如二噁英、二噁英類化合物、TCDD、PAH和PM）可激活細胞內AhR，AhR解離易位至細胞核，與AhR核轉位蛋白（ARNT）形成二聚體轉錄因子。最近研究發現，AhR可與環境毒物相互作用影響機體免疫應答［12］。因此，本研究假設AhR可能有助于調節PM2.5誘導的炎癥中的免疫反應，并在環境因素與炎癥性氣道疾病間起橋梁作用。

細菌溶解產物（broncho-vaxom，BV）是一種由8種細菌（金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、化膿性鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、臭氧克雷伯菌、綠色鏈球菌和肺炎雙球菌）組成的細菌溶解物，已被證明可增強免疫應答，對先天性免疫和后天性免疫反應具有多種調節作用［13］。研究發現，BV可在黏膜相關淋巴組織中誘導免疫調節反應，進而抑制Th2誘導的免疫應答，降低過敏原特異性IgE濃度，增加IL-10分泌［14］。同時，BV可有效治療和預防上呼吸道反復感染、哮喘、COPD、慢性支氣管炎、急性鼻竇炎、過敏性鼻炎、過敏性皮炎［15-17］。因此，課題組推測BV可能是預防和治療PM2.5相關炎癥疾病的新方法。為更好地了解PM2.5暴露及BV治療對小鼠氣道炎癥的作用及機制，本研究旨在探究正常健康小鼠暴露于城市交通相關PM2.5是否會導致氣道炎癥，吸入PM2.5是否通過AhR途徑參與氣道炎癥性疾病發病過程，BV可能是否通過調節免疫失衡減輕PM2.5誘導的小鼠氣道炎癥。

1 材料與方法

1.1 材料SPF級BALB/c雌性小鼠30只，6~8周齡，購自重慶醫科大學實驗動物中心，飼養于重慶醫科大學實驗動物中心代養室，21~24℃，50%~60%相對濕度。本研究經重慶醫科大學動物保護與倫理委員會批準。ELISA試劑盒（eBioscience，SanDiego，CA）；反轉錄酶（Invitrogen）；抗AhR（Sigma-15 Aldrich，USA）；抗β-肌動蛋白（Beyotime）。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5收集采用重慶市環境監測中心的Thermo Scientific TEOM1405-D顆粒監測儀收集2018年12月至2019年9月大氣PM2.5樣品，采樣地點為重慶醫科大學附屬第一醫院3號樓樓頂，周邊為交通繁忙的十字路口且無大型工業工廠。PM2.5收集于預先稱好重量的石英纖維過濾膜，每24 h更換1次過濾膜，換下的石英纖維濾膜在60℃烘箱中干燥6 h后稱重。將含有PM2.5的濾膜切成2 cm×1 cm小塊，浸入100 ml去離子蒸餾水中，超聲振蕩2 h，振蕩液用12層無菌紗布進行過濾，將濾液進行真空冷凍干燥并稱重。無菌生理鹽水配制不同濃度PM2.5混懸液，高壓滅菌，4℃避光保存備用。

1.2.2 動物實驗方案30只小鼠隨機分為對照組、PM2.5暴露組和BV干預組，每組10只。第1~15天，對照組氣管滴注生理鹽水，1次/d，PM2.5暴露組和BV干預組氣管滴注PM2.5懸浮液（8 mg/kg），1次/d；第16~90天，對照組和PM2.5暴露組口服給予生理鹽水，0.2 ml/（只·d），BV干預組口服給予BV溶液（50 mg/ml），0.2 ml/（只·d）。根據預實驗結果和文獻，本研究采用暴露式氣管滴注法染毒［18-20］。末次干預后24 h內處死小鼠，取血、氣管及肺組織保存備用。

1.2.3 HE染色4%多聚甲醛處理小鼠氣管組織，石蠟包埋切片（4~5μm），HE染色，光鏡下觀察組織病理學改變。

1.2.4 ELISA檢測血清細胞因子水平小鼠心臟取血，4℃、1 500 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存備用。按特異性ELISA試劑盒說明檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17和IL-33水平，結果以pg/ml表示。

1.2.5 RT-qPCR檢測AhR mRNA表達采用TRIzol提取液提取肺組織樣本總RNA，隨機六聚體引物和RNase H-反轉錄酶反轉錄為cDNA。采用ABI Prism 7500 PCR系統和SYBR Premix-Taq染料進行實時熒光PCR，檢測mRNA表達。AhR F：5'-TCCCTTATGAGTGCCTTGA-3'，R：5'-GTCTGATTTCCTCGTGTTTC-3'。PCR反應按以下步驟重復2次：50℃2 min，90℃10 min，95℃15 s，循環50次，60℃1 min。比較Ct法計算mRNA相對表達，以β-actin為內參，無模板樣品為陰性對照。

1.2.6 Western blot檢測AhR蛋白表達溶解肺組織，提取蛋白，進行Western blot實驗，采用抗AhR或抗β-肌動蛋白進行一抗孵育，采用ECL化學發光反應試劑盒測定膜中蛋白免疫反應性，醫用膠片中暴露。

1.3 統計學處理采用Medcalc15.2.2軟件進行統計學分析，組間比較采用t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）。數據不符合正態分布時采用Mann-Whitney秩和檢驗，正態分布資料以±s表示，偏態分布資料以“中位數和四分位數間距”表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PM2.5及BV對小鼠氣道炎癥的影響小鼠氣管黏膜HE染色如圖1所示，與對照組相比，PM2.5和BV干預組氣管黏膜中性粒細胞和淋巴細胞浸潤明顯增加，且BV干預組炎癥細胞浸潤輕于PM2.5暴露組，淋巴細胞數明顯少于PM2.5暴露組。

圖1 各組小鼠氣管HE染色（×400）Fig.1 HE staining of trachea of mice in each group（×400）

2.2 PM2.5及BV對小鼠血清細胞因子表達的影響ELISA檢測血清中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13、IL-10、IL-17和IL-33水平，如表1所示，PM2.5暴露組小鼠IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33水平較對照組顯著升高（P<0.05），IL-10水平顯著降低（P<0.05）；IFN-γ與對照組差異無統計學意義（P=0.134）。BV干預組小鼠IL-4、IL-5、IL-13、IL-17、IL-33水平較PM2.5組降低（P<0.05）；BV干預組IL-10水平較PM2.5組顯著升高（P=0.012），BV干預組IFN-γ水平與PM2.5組差異無統計學意義（P=0.353）。

表1 各組小鼠血清中細胞因子表達（±s，pg/ml）Tab.1 Cytokine expressions in serum of mice in each group（±s，pg/ml）

表1 各組小鼠血清中細胞因子表達（±s，pg/ml）Tab.1 Cytokine expressions in serum of mice in each group（±s，pg/ml）

Note：1）P<0.05 vs control；2）P<0.05 vs PM2.5.

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2.3 PM2.5及BV對小鼠肺組織中AhR表達的影響檢測小鼠肺組織AhR mRNA和蛋白表達，PM2.5暴露組AhR mRNA表達（1.861 2±0.086 2）較對照組（1.115 0±0.070 9）顯著增加（P<0.001），PM2.5暴露組AhR蛋白表達（0.890 2±0.092 8）較對照組（0.381 5±0.034 9）顯著增加（P=0.001）。BV干預組AhR mRNA和蛋白表達均較PM2.5暴露組顯著降低（P<0.001，圖2）。

圖2 各組小鼠肺組織AhR mRNA、蛋白表達Fig.2 Expressions of AhR mRNA and protein in lung tis?sue of mice in each group

3 討論

PM2.5是我國空氣污染的主要成分，其表面可吸附各種有毒物質，與多種呼吸系統、循環系統及代謝系統疾病有關。AhR是配體依賴的多功能轉錄因子，參與細胞內外環境變化檢測，最近研究發現，AhR可與環境毒物產生相互作用，影響機體免疫反應［12］。BV目前已被證明可增強免疫反應，對先天性免疫和后天性免疫應答具有多種調節作用［13］。因此，本研究旨在從AhR信號通路激活致Th免疫失衡的角度，探討PM2.5暴露及BV治療對小鼠氣道炎癥的作用及機制。

OGINO等［21］研究提示，PM2.5暴露后小鼠出現相關氣道炎癥反應和免疫紊亂，主要表現為顆粒物暴露后小鼠IL-4、IL-5和IL-13表達增強，而IL-4、IL-5和IL-13是過敏性氣道炎癥的重要募集因子，在介導Th1/Th2細胞免疫失衡中起重要作用。同時，Th17和Th2型免疫反應上調在過敏性氣道炎癥病理生理過程中起重要作用，某些具有酶活性的變應原可誘導上皮細胞產生細胞因子和趨化因子，從而促進Th2反應。隨著輔助性T（Th）細胞新亞群（Th17細胞和Treg細胞）的發現，研究證實Th17細胞可調節Th2反應和嗜酸性粒細胞活化等多個靶點，在氣道炎癥中發揮重要作用。本研究中PM2.5暴露后小鼠出現氣道黏膜炎癥細胞浸潤及Th細胞相關細胞因子失衡，包括Th17相關細胞因子IL-17和Th2相關細胞因子IL-4、IL-5、IL-13、IL-33表達增加，提示Th17和Th2細胞介導的免疫平衡在PM2.5誘導的氣道炎癥中起重要作用。

AhR作為一種配體依賴性轉錄因子，在樹突狀細胞（DC）表面高表達，可與環境中及體內某些代謝產物結合，調節DC分化、成熟及功能，調節人體免疫反應。DC細胞是Th細胞網絡失衡促發細胞因子分泌失衡的核心“閥門”，是前所知功能最強的抗原提呈細胞（APC），是決定naive T細胞向Th1、Th2、Th17和Treg分化的細胞［22］。因此，AhR在調控細胞免疫平衡中可能發揮重要作用。同時，AhR對環境刺激敏感，已被證明是多環芳香烴、二噁英等環境有機污染物致癌、致畸的重要介導者和傳感器。本團隊研究表明，過敏性鼻炎中，AhR配體ITE（噻唑-4-羧酸甲酯AhR激動劑）可通過抑制Th17細胞分化及抑制IL-17產生顯著降低炎癥反應［23］。AhR不僅可介導環境污染物毒性作用，還在炎癥、纖維化、腫瘤、免疫調節、生長發育及維持生理穩態等多種病理生理過程中發揮重要作用。AhR信號通路是環境因素誘導機體疾病的關鍵機制之一，本研究在PM2.5暴露小鼠肺組織中發現AhR mRNA和蛋白表達顯著增加且血清中Th細胞相關細胞因子失衡，因此推測AhR在PM2.5暴露和炎癥性氣道疾病間起橋梁作用，PM2.5可通過激活AhR信號通路誘導氣道炎癥和介導Th1/Th2和Th17/Treg免疫失衡。

BV目前已用于復發性呼吸道感染、哮喘、COPD、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎、鼻竇炎等其他呼吸系統疾病治療，在黏膜相關淋巴組織內誘導免疫調節反應。哮喘小鼠模型中，口服BV有利于調節Th1/Th2平衡，減輕小鼠哮喘模型氣道炎癥，有效預防支氣管哮喘發生發展［24］。此外，口服BV可增加氣道黏膜組織中CD4+CD25+Foxp3+Treg含量，并減弱氣道高反應性［25］。本研究發現，給予PM2.5誘導的氣道炎癥BV干預，IL-17表達顯著減少，IL-10表達顯著增多，AhR表達顯著下調，提示BV可能通過AhR相關通路調節Th細胞間免疫平衡，有望成為PM2.5相關氣道炎癥性疾病治療的新靶點。

綜上所述，城市交通相關PM2.5可誘導正常健康小鼠氣道炎癥及血清中Th相關細胞因子失衡，且PM2.5可能通過AhR信號通路參與氣道炎癥發生發展，而BV可通過AhR信號通路調節免疫反應減輕PM2.5誘導的氣道炎癥，為PM2.5相關氣道炎癥疾病治療提供新靶點。