房顫患者卒中后微栓子與血調節性T細胞、淋巴細胞表面凋亡因子相關性研究

黃小麗 董禮全

（山東大學附屬威海市立醫院全科醫學科，山東威海 264200）

房顫是一種常見的心臟電活動紊亂伴隨心房機械功能障礙的心律失常，是缺血性卒中最重要的獨立危險因素之一，而我國對房顫合并缺血性卒中的診斷率偏低[1-2]。臨床上對房顫患者發生卒中后的病理存在不同認知，不確定腦部是否有微栓子形成；且相比于心血管，腦血管對抗血小板聯合抗凝治療的耐受性更差，用藥后更易引發出血[3]，故臨床需要更多指標進行病情評估。微栓子信號（microembolic signals，MES）是經顱多普勒超聲所能檢測到的血流中通過的微小顆粒信號，既往研究多集中于其對復發性缺血性卒中有預警作用[4]。另有研究表明，調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）和淋巴細胞表面凋亡因子（CD95）的表達可能與缺血性腦卒中的發生發展有關，但尚無針對房顫合并急性缺血性卒中這一患病人群的研究，且MES與上述血液指標的關系尚不清楚[5-6]。本研究旨在探究房顫患者卒中后MES變化，以及MES與Treg和CD95的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年10月至2021年1月山東大學附屬威海市立醫院全科醫學科收治的房顫合并急性缺血性卒中患者111例作為試驗組，其中男性91 例，女性20例；年齡58～75歲，平均年齡（69.1±4.3）歲；患房顫時間1～4年，平均患房顫（3.30±0.47）年。將試驗組按照MES結果分為兩個亞組，分別為陽性亞組和陰性亞組。陽性亞組28 例，其中男性20例，女性8例；年齡59～74歲，平均年齡（68.5±2.2）歲；房顫時間1～3年，平均房顫（2.16±0.29）年。陰性亞組83例，其中男性71例，女性12例；年齡58～77歲，平均年齡（68.8±3.4）歲；房顫時間1～3年，平均房顫（2.55±0.21）年。選取同期收治的不伴房顫的缺血性卒中患者73例作為對照組，其中男性38例，女性35例；年齡58～75歲，平均年齡（70.5±3.2）歲。試驗組與對照組、試驗組兩個亞組患者之間的年齡、性別構成比等一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究已獲得山東大學附屬威海市立醫院醫學倫理委員會批準。所納入患者均已簽署知情同意書。納入標準：①急性缺血性卒中診斷標準并經臨床確診[7]；②符合2014年英國健康和臨床療效國家研究院（NICE）房顫診療指南的診斷標準并經臨床確診[8]；③患者急性缺血性卒中發病1周內；④美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評分≤20分[9]；⑤患者可配合影像學檢查。排除標準：①伴腫瘤、免疫性疾病、血液系統疾病、急性感染性疾病者；②近4周有外傷史或外科手術史者；③病情危重不能完成研究者；④大腦中動脈主干梗死而不能取得超聲血流信號者。

1.2 方法 MES檢測：患者入院后24 h內完成經顱多普勒超聲（TCD）的MES監測（EMS-9EBX2P 型超聲診斷儀，生產商：深圳市德利凱醫療設備股份有限公司）。患者取安靜仰臥位，由2名神經內科醫師共同監測。以2 MHz探頭取得腦梗死病灶側大腦中動脈清晰信號，固定頭架，深度50～60 mm，兩點間距大于6 mm，取樣容積為6～12 mm。采用1995年第9屆國際腦血液循環會議制定的標準判斷MES信號：①時程短暫，持續時間＜300 ms的顆粒信號；②強度較背景血流信號≥3dB；③單向出現于多普勒頻譜中；④音頻為“劈啪音”或“鳥鳴聲”；⑤在心動周期內隨機出現；⑥在2個監測深度存在時間延遲。檢測完畢回放每個微栓子信號，除外偽差和干擾。檢測時間60 min，將監測結果MES≥1定義為MES陽性。Treg、CD95檢測：患者入院24 h內采集肘靜脈血2 mL，以二胺四乙酸抗凝，6 h內進行流式細胞術檢測（EPICS XL-4型流式細胞儀，美國貝克曼公司生產）。每份樣本取4支流式專用試管，加入全血標本100 μL，冰上避光孵育30 min，加入Optilyse C溶血素500μL，室溫避光30 min，加入2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS），1 200 r/min離心5 min，棄上清。分別加入熒光標記抗體及同型對照，其中Treg為小鼠抗人熒光單抗CD25-FITC、CD4-PE-Cy5及同型對照（生產商：法國Immunotech公司），CD95為小鼠抗人熒光單抗CD95-PE及同型對照（生產商：晶美生物公司）。加入0.5 mLPBS重懸細胞，上機檢測。以FS-SS設門分析外周血Treg細胞（CD25表達熒光強度＞100者為CD4+CD25high調節性T細胞）和淋巴細胞表面CD95的表達。

1.3 觀察指標 ①MES檢測情況。MES陽性率=[MES陽性例數/總例數]×100%。②血Treg水平及淋巴細胞表面CD95水平。

1.4 統計學分析 采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用[例（%）]表示，行χ2檢驗；計量資料均符合正態分布，用（）表示，其中方差齊者行t檢驗、方差不齊者行t′檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 試驗組和對照組患者MES陽性率及CD95、Treg水平比較 試驗組患者MES陽性率高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。試驗組患者Treg水平低于對照組，而CD95水平高于對照組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），見表 1。

表1 試驗組和對照組患者MES陽性情況、Treg和CD95水平的比較

2.2 兩亞組外周血Treg、CD95水平比較 MES陽性亞組患者Treg水平低于陰性亞組，MES陽性亞組患者CD95水平高于陰性亞組，差異均有統計學意義（均P＜ 0.05），見表 2。

表2 MES陽性亞組與MES陰性亞組Treg、CD95比較（，%）

表2 MES陽性亞組與MES陰性亞組Treg、CD95比較（，%）

組別 例數 Treg CD95 MES陽性亞組 28 7.49±1.78 36.97±2.73 MES陰性亞組 83 9.48±2.72 33.76±1.13 t′值 4.42 6.05 P值 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

相比腦動脈狹窄導致缺血性卒中患者，房顫導致的栓塞沒時間形成側支循環，急性卒中時缺血半暗帶相對小，壞死腦組織多，致殘率高。MES是經顱多普勒超聲所能檢測到的血流中通過的微小顆粒信號，這些小顆粒本質上多為微小血栓碎片[10]。MES增加是急性缺血性腦卒中復發的預測因子[11]。本研究發現，相對于不伴房顫的卒中患者，房顫合并急性缺血性卒中患者超聲檢查的MES陽性率高（P＜0.05）。分析其原因，一方面可能是由于房顫患者心房內栓子脫落急性卒中發生以后仍可能有部分贅生物殘存并且脫落；另一方面可能是心房內再次形成新的不穩定的贅生物體積更小、數量更多，也更容易脫落。

腦卒中后往往還伴隨著應激反應及繼發的免疫炎癥反應。Treg是重要的免疫細胞，是重要的卒中后炎癥反應的保護因子。卒中發生后，急性期其血循環濃度越低，可能腦損傷越重[12-13]。CD95為凋亡因子，可能與腦卒中時機體啟動神經元缺血受損后的凋亡反應及繼發膠質細胞增生反應有關[14-15]。本次研究結果顯示：試驗組患者Treg水平低于對照組、CD95水平高于對照組；MES陽性亞組患者Treg水平低于MES陰性亞組、CD95水平高于MES陰性亞組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。這提示急性卒中后的應激狀態中，房顫且MES陽性患者的免疫失調更嚴重、炎癥反應更為劇烈、神經元凋亡更嚴重。

綜上所述，房顫合并缺血性卒中患者在急性期進行微栓子信號檢查及外周血Treg、CD95的檢測有助于對其病理過程的進一步認識，微栓子的存在可能加重Treg介導的免疫失調及CD95參與的凋亡反應，因此對于存在微栓子的這類患者，更積極的抗凝治療和更緊密的臨床相關指標檢測，對于患者獲得更好的預后可能有積極意義。