三七超低溫破壁粉質量標準研究

黃冬芳 韋金玉 梁 潔,2,3 陳輝華 祁金麗 胡 玨 劉 民 趙立春,2,3

1.廣西中醫藥大學藥學院，廣西南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術研究中心，廣西南寧 530200；3.廣西優勢中成藥與民族藥開發工程技術研究中心，廣西南寧 530200；4.廣西桂盛合中藥制藥有限公司，廣西南寧 532100

三七為五加科植物三七Parmx notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根莖[1]，三七是我國貴重中藥，具祛瘀、止血、滋補等作用[2-3]。三七粉、三七片、熟三七和熟三七粉是三七現有的飲片規格[4-5]；而三七粉既是目前最常用的飲片形式，也是臨床上最常應用的粉末規格[6-8]。粒徑是影響有效成分溶出的關鍵因素[9]，中藥材經粉碎成細粉后減小粒徑，由此可提高生物利用度[10]。超微粉碎技術是近年興起的一種新型技術，可增加藥材的細胞破壁率，明顯提高有效成分的溶出[11-14]，有利于與給藥部位直接接觸[15]。2018 年云南省發布了呈凍干物質狀態的三七、三七粉、三七切片的中藥飲片炮制規范，表明真空冷凍干燥技術已開始應用于三七的炮制，且可以有效地保存藥效成分[16-17]。真空冷凍干燥技術，指在超低溫條件下及真空狀態下獲得的一種物質狀態，能保持藥物的原有特性，提高其穩定性[18-19]。

三七粉可內服和外用[20]，外用于止血，吞服可用來防治高血壓，對于身體衰弱、食欲不振等癥狀也有一定的功效[21-24]。現代臨床上常將三七粉用于止血、治療肝損傷、防治冠心病、增強免疫力[25-27]。三七超低溫破壁粉首先是用真空冷凍干燥技術將藥材進行超低溫干燥，再通過破壁技術的加工而得到的。與普通的三七粉比較，處理后的三七超低溫破壁粉利用價值提升，細胞、組織破壁可增大有效成分的溶出速度和溶出度，同時還具有細度穩定、不易團聚的優勢。目前，超微三七粉質量標準的相關研究較多，但關于三七超低溫破壁粉質量控制方面的顯微鑒別和薄層鑒別研究尚少見，本研究開展三七超低溫破壁粉的較為全面的質量研究，為建立三七超低溫破壁粉的質量標準提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

SQP 電子分析天平（萬分之一，賽多利斯科學儀器有限公司）；DHG9240A 電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；TGL-16G 高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；KQ5200 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZF-7型暗箱式三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；AFZ-1001-U 艾科浦超純水系統（重慶頤洋企業發展有限公司）；硅膠G 板（青島海洋化工有限公司）；HH-S4 數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）；BT224S 光學生物顯微鏡（廈門麥克奧迪實業有限公司）；Waters e2695 高效液相色譜儀（美國沃特世公司）。

1.2 試藥

10 批三七超低溫破壁粉（廣西桂盛合中藥制藥有限公司，批號：20200301、20200302、20200303、20200501、20200502、20200503、20200601、20200602、20200603、20200701）；對照品[人參皂苷Rb1（批號：wkq19012107-wkq20010707）、人參皂苷Rg1（批號：wkq19040208-wkq20022711）、三七皂苷R1（批號：wkq19043009-wkq20022804）]均來源于四川省維克奇生物科技有限公司，純度≥98%；乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 性狀特征

10 批三七超低溫破壁粉粉末的粗細程度、顏色、氣味等形狀特征基本一致，均為灰黃色的粉末，氣微，味苦回甜。

2.2 顯微特征

取本品粉末適量，加水合氯醛透化后制成蠟片，于顯微鏡下觀察，發現其薄壁細胞碎片眾多，偶見完整細胞。淀粉粒甚多，單粒圓形、半圓形或圓多角形，直徑4～30 μm；復粒由2～10 余分粒組成。樹脂道碎片直徑21～165 μm，含黃色分泌物。導管為梯紋導管、網紋導管及螺紋導管，碎片長20～280 μm，直徑15～55 μm。木薄壁細胞團偶見，長95～160 μm，寬45～85 μm。草酸鈣簇晶少見，直徑50～80 μm。見圖1。

圖1 三七超低溫破壁粉顯微特征圖

2.3 薄層色譜鑒別

取本品粉末0.5 g，加水5 滴，攪勻，加水飽和的正丁醇5 ml，密塞，振搖10 min，離心，取上清液，加3 倍量正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層，取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 ml 使溶解，作為供試品溶液。

另取人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及三七皂苷R1，加甲醇制成每1 ml 各含0.5 mg的混合溶液，作為對照品溶液。吸取上述兩種溶液各1 μl，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇:水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸溶液（1→10），105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；置紫外光燈（365 nm）下檢視，顯相同的熒光斑點。10 批樣品按照上述方法進行檢驗，10 批樣品與對照品均有相似的斑點，薄層鑒別見圖2。

圖2 10 批樣品的薄層色譜圖

2.4 水分、灰分及浸出物檢測

參照2020 版《中華人民共和國藥典》（四部）[28]通則水分測定法、灰分測定法、浸出物測定法對樣品進行測定，結果見表1。結合實際應用，初步擬定本品水分不得過12%，總灰分不得過4%，酸不溶性灰分不得過2%，醇浸出物含量不得少于15%。

表1 三七超低溫破壁粉的水分、總灰分、酸不溶性灰分及醇浸出物測定結果（%）

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件 Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序為（0～12 min，19%B；12～60 min，36%B，60～65 min，38%B）；進樣量為10 μl；柱溫為30℃；流速為0.8 ml/min；檢測波長為203 nm。理論板數按三七皂苷R1峰計算應不低于4000。

2.5.2 混合對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1適量，加甲醇制成每l ml含人參皂苷Rg10.5033 mg/ml、人參皂苷Rb10.5667 mg/ml、三七皂苷R10.1958 mg/ml的混合溶液，即得。

2.5.3 供試品溶液制備 取三七超低溫破壁粉（批號：20200501）約0.6 g，精密稱定，精密加入甲醇30 ml，稱定重量，放置2 h 后，超聲30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。對照品及三七超低溫破壁粉高效液相色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品及三七超低溫破壁粉高效液相色譜圖

2.5.4 線性關系考察 精密稱取三七皂苷R12.35 mg、人參皂苷Rg16.04 mg、人參皂苷Rb16.8 mg，分別制成0.7833、2.0133、2.2667 mg/ml的貯備液。精密吸取三七皂苷R1貯備液適量，制成一系列濃度為0.0196、0.0979、0.1958、0.3917、0.5875、0.7833 mg/ml，精密吸取人參皂苷Rg1貯備液適量，制成一系列濃度為0.0503、0.2517、0.5033、1.0067、1.5100、2.0133 mg/ml，精密吸取人參皂苷Rb1貯備液適量，制成一系列濃度為0.0567、0.2833、0.5667、1.1333、1.7000、2.2667 mg/ml，注入高效液相色譜儀，以濃度（mg/ml）為橫坐標X，峰面積積分值Y 為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸，結果見表2。

表2 線性關系實驗結果

2.5.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μl，按照“2.5.1”項下色譜條件進行測定，重復進樣6 次，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD 值分別為1.62%、1.55%、1.62%，結果表明儀器精密度良好。

2.5.6 重復性試驗 取三七超低溫破壁粉（批號：20200501）6 份，按“2.5.3”項下方法配制成供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件進行測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量的RSD 值分別為2.62%、2.65%、2.55%，結果表明本方法具有較好的重復性。

2.5.7 穩定性試驗 取三七超低溫破壁粉（批號：20200 501）按“2.5.3”項下方法配制成供試品溶液，按“2.5.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h 進行測定，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD 值分別為2.52%、2.41%、2.91%，結果表明樣品溶液在24 h 內穩定。

2.5.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的三七超低溫破壁粉（批號：20200501）6 份，加入相應量（1∶1）的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1，按“2.5.3”項下方法處理后，按“2.5.1”項下色譜條件進行含量測定，計算回收率，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的平均加樣回收率分別為102.8%、97.2%、96.0%，RSD 分別為1.59%、1.48%、1.45%。

2.5.9 樣品的含量測定 取10 批樣品，每批樣品平行測定3 次，按“2.5.3”項下方法制備，按“2.5.1”項色譜條件進行測定，含量測定的結果見表3。

由表3 可知，樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的含量分別在0.62%～0.64%，3.07%～3.96%，2.25%～2.49%，按干燥品計算，10 批三七超低溫破壁粉中每批含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總量在6.15%～6.88%，每批總量均≥6.00%，故建議按干燥品計算三七超低溫破壁粉含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總量不得少于6.00%。

表3 10 批樣品含量測定結果（%）

3 討論

在薄層鑒別的考察中，嘗試過同時鑒別4 種皂苷成分，人參皂苷Re 和三七皂苷R1的Rf 值相近，很多展開系統難以分開，結合本研究中的含量測定指標成分有人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1，考慮到薄層鑒別與含量測定盡量選擇一致的指標性成分進行研究，能更好、更精準地進行質量控制。故最后只選用了人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1作為對照品進行薄層的鑒別。

對于色譜條件的選擇，參考2020 年版《中華人民共和國藥典》一部[1]中三七的含量測定項下色譜條件，但經過考察，最終選擇流速為0.8 ml/min，在該流速下色譜峰分離度最佳；且對洗脫梯度進行了調整，因人參皂苷Rb1出峰時間很靠后，故將梯度洗脫的時間延長至65 min，保證各個峰都能有較好的分離效果。

真空冷凍干燥技術和破壁技術的相結合是為順應中醫藥現代化的需要而發展起來的一種新型藥材加工技術，真空冷凍干燥技術可最大程度地保持藥材的營養價值；對藥材進行破壁處理，有效成分能實現更大的利用價值，但其粉體性質發生了某些變化，這些變化可能會對三七超低溫破壁粉的質量有影響。因此，開展對三七超低溫破壁粉質量標準研究，可進一步完善三七超低溫破壁粉的質量標準。本研究所建立的方法簡便、準確且可靠，可以作為三七超低溫破壁粉的質量控制方法。