帕金森病的生物信息學分析及潛在治療中藥的預測

趙佳佳 木尼熱·艾海提 張宇潔 楊俊玲 葉紅霞 許 忠

烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院藥學部，新疆烏魯木齊 830000

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一種神經(jīng)衰退性疾病，通常表現(xiàn)為運動遲緩，自主活動受限，集中體現(xiàn)在感覺、認知和睡眠障礙等方面[1]。此病通常發(fā)生在中腦黑質紋狀體區(qū)域，主要是多巴胺缺失[2]，目前，發(fā)病原因和機制尚不清楚。臨床西藥治療主要應用左旋多巴，使用該藥后雖然能減輕患者的臨床癥狀，但并不能從根源上阻止神經(jīng)退化，且有較大的副作用[3]。近年來，中藥及其復方制劑在治療PD的神經(jīng)保護方面開展了大量研究，并獲得了成效[4-6]，已成為PD 防治藥物開發(fā)的熱點。

但是中醫(yī)臨床用藥多是個人經(jīng)驗總結，雖然療效顯著，但對PD的治療機制并不能明確解釋。因此，本研究運用生物信息學分析，篩選出PD 關鍵致病基因和信號通路，同時預測潛在治療中藥，為PD的發(fā)生機制和中藥治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 PD 差異表達基因的獲取

通過GEO 數(shù)據(jù)庫檢索PD 患者和健康人的基因表達信息，運用GEO2R 分析PD 組和健康對照組間的基因差異，將P <0.05，F(xiàn)C>1 倍的基因納入差異表達基因，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫，檢索PD 相關基因，兩個結果中共有基因為PD的顯著差異基因。

1.2 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interactions，PPI）網(wǎng)絡的構建

用PPI 網(wǎng)絡分析基因或蛋白間的相互作用，通過String 數(shù)據(jù)庫構建PPI 網(wǎng)絡，將得到的PPI 信息導入Cytoscape 軟件，得到PPI 網(wǎng)絡圖可視化。

1.3 靶點功能通路注釋

經(jīng)過GO 和KEGG 分析可知差異基因功能，進而分析其在疾病中的作用機制。將差異基因導入Metascape 數(shù)據(jù)庫，選定物種為“homo sapiens”，校正名稱，所有的名稱都必須使用官方名稱。設定閾值P ＜0.05，進行分析，并對富集分析結果進行可視化。

1.4 靶點-信號通路網(wǎng)絡圖

使用Cytoscape 軟件，構建靶點-信號通路網(wǎng)絡圖，以展現(xiàn)通路的關鍵基因。

1.5 潛在治療中藥篩選

運用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）和Coremine Medical 信息檢索平臺，輸入PD的關鍵基因，檢索出與該基因相關的潛在治療的中藥和化合物。

1.6 靶點-化合物分子對接

從PBD 數(shù)據(jù)庫中下載關鍵基因晶體結構，與活性化合物進行分子對接。

2 結果

2.1 差異表達基因篩選結果

按照篩選條件，得到基因表達譜系列（GSE22491）、（GSE54536），包括13例PD 患者和15 名健康對照標本，經(jīng)GEO2R 分析，共獲取1610 個差異基因，其中上調基因1159 個，下調基因451 個；與GeneCards 數(shù)據(jù)庫中PD 相關基因取交集，最終篩選出576 個顯著差異基因，包括上調基因428 個，下調基因148 個，繪制韋恩圖和火山圖，具體見圖1。

圖1 顯著差異基因的韋恩圖和火山圖

2.2 靶點基因PPI 網(wǎng)絡分析

在String 中輸入428 個上調基因，148 個下調基因，得到PPI 網(wǎng)絡圖，其等級值由節(jié)點的大小來代表。顯著上調基因：SRC、HSP90AA1、EGF、MMP9、FOS等；下調基因：TNF、CXCR4、CD19、FCGR2A、FCGR2B 等。見圖2。

圖2 靶點基因PPI 網(wǎng)絡圖

2.3 GO 富集和KEGG 通路分析

使用Metascape 對上調差異基因進行GO 富集和

KEGG 通路分析，得到P <0.05的GO 條目1515 個，生物過程（biological process，BP）條目1265 個，細胞組成（cellular component，CC）條目122 個，分子功能（molecular function，MF）條目128 個，部分顯著條目見圖3。KEGG 通路條目242 個，PI3K-Akt 信號通路得分最高，其次是MAPK 信號通路。見圖4（封四）。

圖3 GO 富集分析

使用Metascape 對下調差異基因進行GO 富集和KEGG 通路分析，得到P <0.05的GO 條目546 個，BP 條目452 個，MF 條目53 個，CC 條目41 個，部分顯著條目見圖3。KEGG 通路條目104 個，Tight junction信號通路得分最高，其次是Cancer、Neuroactive ligandreceptor interaction 信號通路。見圖5（封四）。

2.4 靶點-信號通路網(wǎng)絡圖

利用Cytoscape 繪制通路網(wǎng)絡圖，圈代表通路，圈內代表靶點基因，形狀越大代表富集越顯著。上調核心基因：SRC、MAPK14、ABL1、PRKCB、HSP90AA1 等，下調核心基因：GRIN1、CHRNA7、NOS1、GRIN2D、BCL2等，具體見圖6。

圖6 靶點基因-信號通路圖網(wǎng)絡圖

2.5 潛在治療中藥篩選

結合PPI 分析結果和靶點-信號通路網(wǎng)絡圖分析結果，主要顯著基因有SRC、MAPK14、HSP90AA1、TNF、CXCR4、GRIN1。將其輸入TCMSP、Coremine Medical中，超過4 個基因共同關聯(lián)的中藥有30 味，前三位為虎杖、雷公藤、沙棘，具體見表1。

表1 潛在治療中藥頻數(shù)分布

2.6 靶點-化合物分子對接

將顯著基因SRC、MAPK14、HSP90AA1、TNF、CXCR4、GRIN1 輸入TCMSP、Coremine Medical 檢索口服生物利用度最高的潛在化合物，并進行分子對接，結果見表2、圖7。

圖7 顯著基因分子對接

表2 分子對接信息表

3 討論

結合PPI 網(wǎng)絡分析和靶點-信號通路網(wǎng)絡圖分析結果，主要顯著基因SRC的基因產(chǎn)物c-SRC 在多種腫瘤細胞中可過度表達并高度激活，與MAPK 和PI3K/Akt 信號途徑密切相關。HSP90AA1 參與細胞內蛋白質的合成與折疊，在保護細胞免受化療、缺氧等應激損傷中發(fā)揮重要作用[7-8]。MAPK14 可促進炎癥因子的調控激活，宿主細胞可通過蛋白抑制MAPK14 從而抑制病毒，并且與細胞分化、增殖、免疫調節(jié)密切相關[9]。TNF 參與細胞的凋亡、生長、炎癥反應和免疫功能等[10]。CXCR4 趨化因子受體在急性炎癥反應過程中通過快速募集到炎癥部位參與構成急性炎癥的第一道防線[11]。

KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)Neuroactive ligand-receptor interaction 信號通路，該通路是質膜上所有與細胞內外信號通路相關受體和配體的集合，其中受體基因Chrm3 上調會增強膽堿能功能，與促進學習和提高記憶能力有關[12]。Tight junctions 信號通路能緊密連接表皮細胞，防止機械損傷和體外有害物質入侵，調節(jié)水、電解質及炎癥細胞的選擇性滲透[13]。PI3K-Akt 信號通路參與細胞代謝、生存和死亡，該通路激活受阻與腦梗死、PD 等疾病的發(fā)生均密切相關[14]。使用PI3K 抑制劑wortmannin 可阻斷PI3K/Akt 通路，解除p-GSK-3β，加重多巴胺神經(jīng)元凋亡[15]。MAPK 信號通路可有效抑制神經(jīng)元損傷和死亡[16-18]，是PD 類疾病發(fā)病的主要信號通路。

潛在治療中藥虎杖的藥理實驗顯示[19-20]，其可有效抗菌抗病毒、擴張血管降低血壓、抗血栓、抗炎鎮(zhèn)痛及調節(jié)代謝等，在心血管方面療效顯著。虎杖中白藜蘆醇及白藜蘆醇脂質體對PD 模型大鼠黑質細胞具有明顯的保護作用。潛在治療中藥雷公藤具有活血化瘀、殺蟲消炎、降低血黏度、改善微循環(huán)等作用，并且雷公藤內酯對1-甲基-4-苯基-吡啶PD 大鼠模型具有神經(jīng)保護作用[21]。潛在治療中藥沙棘具有祛痰止咳、消食化滯、活血散瘀的功效，能增強免疫，抗腫瘤，抑制血栓、改善心腦血管功能等。針對PD 患者不同程度的瘀血阻絡，均可明顯改善[22-23]。

化合物L-絲氨酸在細胞膜及神經(jīng)細胞鞘形成等過程中發(fā)揮重要作用[24]。酪氨酸在甲狀腺機能亢進等疾病治療中有重要作用。雷公藤甲素具有抗老年性癡呆癥作用，有效抑制Aβ 誘導的星形膠質細胞活化，減少細胞因子等炎癥介質的釋放，減輕Aβ 所致的大腦皮質膽堿能纖維損害，改善學習記憶能力[25]?？Х纫蛟谥委熒窠?jīng)衰弱和昏迷復蘇作用顯著，有助于改善PD 患者的運動能力[26]。

綜上所述，本研究從生物信息學角度系統(tǒng)分析了PD的病理機制和潛在治療中藥。通過SRC、MAPK14、TNF、CXCR4、GRIN1 等靶點作用，調控PI3K-Akt、MAPK、Tight junction 等信號通路來達到治療目的，為PD的臨床治療提供參考依據(jù)。