適用熱區芒果園的木霉生物有機肥研制及其應用

朱佳芯，商美妮，李 榮，劉紅軍，喬策策，陶成圓，沈宗專，沈其榮

（南京農業大學資源與環境科學學院，江蘇 南京 210095）

芒果是世界五大熱帶水果之一，也是我國熱帶主要種植果樹之一，已成為我國華南熱區農業的支柱產業之一［1］。但我國華南熱區土壤淋溶現象強，有機質分解快，導致土壤中有機質含量普遍偏低，隨著現代集約化農業的發展而逐漸出現了農作物產量及品質下降等問題［2］。此外，我國熱區具有高溫多濕、太陽輻射強、降雨不均勻等氣候特征，加之芒果園樹體遮蔭有限，使得芒果園表層土壤溫度較高，易損傷根系，影響果樹養分的吸收并誘發病蟲害的發生，制約了熱區芒果產業的高效及綠色發展［3］。

生物有機肥是指特定功能微生物與有機物料復合而成的一類兼具微生物肥料和有機肥效應的肥料。生物有機肥具有普通商品有機肥的功能特性，如提升土壤有機質、促進土壤養分釋放、增加土壤生物肥力等作用，進而促進植物生長，提高作物產量及品質［4］；因其所含的功能菌可在作物根系表面定殖并產生生長素、拮抗物質等次級代謝產物還具有明顯地調控土壤微生物區系作用，誘導土壤形成抑制土傳病害發生的能力［5］或調節作物代謝而促進生物量的積累［6］。目前有關生物有機肥施用后對熱區芒果生物學效應的研究報道較少，更無篩選適用于熱區芒果園的功能菌種進而研制其專用生物有機肥的報道。我國熱區土壤類型多為紅壤、磚紅壤等，其pH 普遍偏低且呈酸性，而酸性環境更有利于真菌存活，因此更適合篩選功能真菌菌株進行生物有機肥研制。

木霉是自然界中分布較廣泛的一種絲狀真菌，主要存在于土壤、腐爛的木材及植物殘體中［7］，可通過分泌多種植物生長激素提高土壤養分利用率，增強根際定殖能力等機制來發揮促生作用［8］。然而，木霉的生長易受到環境因子尤其是溫度的影響，研究表明28～30℃是木霉菌生長的最適溫度［9］，而熱區芒果園表層土壤溫度較高，因此，有必要從熱區土壤中篩選耐熱木霉菌株，研制適應熱區環境條件的木霉生物有機肥以促進芒果的生長，提高果實的產量和品質。

本實驗室從溫帶氣候區域江蘇農田土壤中篩選得到的貴州木霉NJAU4742 菌株及用其研制的木霉生物有機肥對黃瓜、辣椒、番茄等作物有良好的促生效果［10］，但其對溫度較為敏感，在熱區的增產效果存在不確定性。因此，本研究擬從熱區土壤中分離篩選適溫范圍較寬的促生木霉菌株并研制芒果專用生物有機肥，通過盆栽及田間試驗驗證比較其與用貴州木霉NJAU4742 研制的生物有機肥的促生效果差異，以期為熱區芒果園研發出專用生物有機肥，進而為熱區農業高效綠色生產提供產品及技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：貴州木霉NJAU4742（Trichoderma guizhouense NJAU4742），由江蘇省固體有機廢棄物資源化高技術研究重點實驗室提供。

供試黃瓜品種：供試黃瓜品種為“露豐黃瓜”，購于江蘇省農業科學研究院。

供試肥料：供試普通有機肥中有機質含量45%，含氮（N）1.5%、磷（P2O5）2.5%、鉀（K2O）1.3%；供試酸解氨基酸由江蘇省江陰市聯業生物科技有限公司提供，其含16.9%的總氨基酸、10.2%的游離氨基酸，含氮（N）4.6%、磷（P2O5）0.4%、鉀（K2O）0.07%；盆栽及田間所用生物有機肥由普通有機肥添加木霉固體菌種摻混制成，其養分含量與普通有機肥一致；供試化肥中氮肥為尿素（N 46.4%），磷肥為過磷酸鈣（P2O518%），鉀肥為硫酸鉀（K2O 52%）。

盆栽供試土壤：盆栽供試土壤為高砂土，采自江蘇省如皋市搬經鎮，基本理化性質如下：pH 8.2，有機質含量7.1 g/kg，全氮含量0.6 g/kg，全磷含量0.8 g/kg，全鉀含量2.4 g/kg，有效磷含量7.8 mg/kg，速效鉀含量21 mg/kg。

孟加拉紅培養基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂20 g，孟加拉紅0.03 g，氯霉素0.1 g，蒸餾水1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

木霉選擇性培養基：孟加拉紅培養基中添加氯霉素0.3 g，鏈霉素90 mg，五氯硝基苯0.2 g，曲拉通1 mL，于倒平板前加入到三角瓶中。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 自然，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖培養基（PD）：除不加瓊脂外，其他配方與PDA 培養基一致。

1.2 芒果園篩菌用土壤樣品的采集

于2017 年10 月從海南省樂東黎族自治縣佛羅某芒果園（18°35′38″N，108°43′5″E）采集篩菌用的土壤樣品。該果園多為10 年樹齡以上的芒果樹，隨機選定10 棵芒果樹，用直徑38 mm的土鉆在每棵芒果樹滴水線附近任意采取1 個0～20 cm的表土土柱，10 棵樹的土柱混勻以作篩菌用土壤樣品，于4℃下保存備用。

1.3 功能木霉菌株的初篩

稱取芒果土壤樣品5 g 至載有45 mL 無菌水的100 mL 錐形瓶中，28 ℃、170 r/min 振蕩30 min，制成土壤懸液。吸取土壤懸液0.1 mL，涂布于木霉選擇性平板上，重復10 個平板，28℃培養2 d，在平板上挑選形態各異的菌落接種于PDA 平板上，純化3 次以上。在無菌條件下，用直徑為5 mm的打孔器在長勢一致的木霉PDA 平板上打孔取樣，用鑷子小心將菌餅移接入新鮮PDA 平板（9 cm）中心，分別放置于35 和40℃培養箱中恒溫培養，48 h 后采用十字交叉法測量菌落直徑，篩選出能在35 和40℃正常生長且生長較快的木霉菌株。

1.4 初篩木霉菌株的生物有機肥試制

將初篩獲取的木霉菌株接種到PD 培養基中，進行液體發酵，發酵溫度為28℃，攪拌速度為170 r/min，發酵時間為96 h，得到木霉發酵液。經鏡檢，每毫升發酵液中木霉孢子數大于1×107個。將100 g 秸稈（干重）和200 mL 水混合并加入6.6 mL 酸解氨基酸，拌勻后115℃滅菌1 h。滅菌冷卻后，接入20 mL 上述制備好的木霉發酵液，28℃培養7 d，以淺盤法［11］發酵制得木霉固體發酵物，放于4℃冰箱保存。經鏡檢，每克（干重）固體木霉菌種中含木霉孢子數為5×109個。將木霉固體發酵物按10%（w/w）的比例摻混于普通有機肥中，制成木霉生物有機肥。

1.5 功能木霉菌株的室內盆栽復篩實驗設計

于2018 年7～8 月 及9～10 月在江蘇省宜興中宜生物肥料工程中心溫室分別開展兩季盆栽試驗，篩選促生效果最優的木霉生物有機肥產品，每季盆栽試驗設置以下4 個處理：1）不施肥對照（CK）；2）化肥處理（CF），只施化肥；3）普通有機肥處理（OF），施用普通有機肥；4）木霉生物有機肥處理（T-BIO），只施木霉生物有機肥。各處理等養分設置，用化肥補齊養分，具體施肥信息見表1。每個處理共6 盆，每盆裝土1.6 kg，于裝土前將所需有機肥及化肥一次性施入并與土拌勻后裝盆備用。每盆移栽一棵長勢均一的兩葉一心的健康黃瓜苗，正常管理。在30 d 時測定各個處理的黃瓜植株的地上部鮮重和干重。

表1 不同處理的施肥用量 （g/盆）

1.6 盆栽土壤樣品采集和指標測定方法

試驗于黃瓜的初花期（30 d）測定黃瓜植株地上部鮮重和干重，用剪刀將其地上部與地下部分離，植株裝進信封并稱其鮮重，放置烘箱內，105℃殺青30 min，75℃烘干至恒重。每季黃瓜收獲時，各處理隨機選擇3 株健康黃瓜，輕輕抖落附著在根系表面的土壤，裝入無菌自封袋，放于4℃冰箱儲存。土壤中木霉屬數量的測定采用平板稀釋涂布計數法，稱取5 g 樣品溶于45 mL 無菌水中，振蕩30 min 保證樣品與無菌水混合均勻后進行梯度稀釋，涂布于木霉選擇性培養基平板上，28℃培養48 h 后計數。

1.7 田間試驗設計

田間試驗于2018 年9 月至2019 年6 月在海南省樂東黎族自治縣佛羅某芒果園（18°35′38″N，108°43′5″E）進行。供試芒果園樹齡為10 年，長勢相似。果園土壤是砂壤土，基本土壤理化性狀如下：pH 6.24，有機質含量6.31 g/kg，全氮含量0.09 g/kg，有效磷含量15.38 mg/kg，速效鉀含量78.11 mg/kg。于2018 年9 月，上一茬芒果收獲后施入基肥，本試驗共設計4 個處理：1）不施肥對照（CK）；2）化肥處理（CF），只施化肥；3）普通有機肥處理（OF），施用8 kg 普通有機肥；4）木霉生物有機肥處理（T-BIO），施用8 kg 木霉生物有機肥。各處理等養分設置，用化肥補齊基肥養分差（表2）。每個處理選擇6 棵芒果樹進行肥料試驗，除不施肥對照不施入任何肥料外，其他處理的追肥及其他農事操作與果園日常操作一致。于2019 年6 月芒果收獲期進行產量及品質測定。

表2 不同處理的基肥施用量 （kg/棵）

1.8 田間土壤樣品采集和指標測定方法

在芒果收獲期，在每棵芒果樹滴水線附近隨機采取1 個0～20 cm的表土土柱，每個處理每2 棵樹的土柱混勻組成一個樣品保存，經風干磨細過篩后，測定其基本理化性質。待果園整體成熟度達到采收要求時，將各處理每棵樹上所有果實采摘后單獨計重，即為所有果實重量；將其中重量大于100 g的芒果挑選出來分別稱重，即為商品大果重。每個處理分別從每棵樹上隨機挑取2 個商品大果，切取其中間部位，測定果實中的可溶性固形物、維生素C 和可溶性糖含量。可溶性固形物含量的測定參照張勁等［12］的方法，維生素C 含量的測定采用高效液相色譜法［13］，可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法［14］。土壤理化性質測定參照土壤農化分析［15］。

1.9 功能木霉菌株的鑒定

采用ITS 及TEF 分子標記鑒定篩選所得促生效果最優的木霉生物有機肥產品中的木霉菌株的分類信息。將該功能菌株接種于新鮮PDA 培養基上，28℃培養3 d 后刮取木霉菌絲體，利用OMEGA 真菌DNA 提取試劑盒提取DNA。用ITS 和tef1 引物擴增菌株ITS 及tef 基因片段進行分子鑒定。ITS 擴增引物分別為ITS1：5’-AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GG-3’和ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’；tef 擴增引物為：EF1H：5’-ATG GGT AAG GAA GAC AAG AC-3’和EF2T：5’-GGA AGT ACC AGT GAT CAT GTT-3’。擴增條件參照原始文獻［16］，擴增產物送由南京擎科生物科技有限公司測序。將測序所得ITS 及tef 基因序列與GenBank 數據庫進行Blast 比對分析，獲取分類信息。

1.10 數據處理

采用Excel 2007 和SPSS 22.0 軟件進行數據統計分析，使用單因素方法分析（ANOVA）進行數據比較，最小顯著差異法（LSD）檢驗進行多重比較（P＜0.05）。采用Mr Bayes v3.2.6 構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 功能木霉菌株的初篩結果

從海南芒果土壤中初步篩選出木霉候選菌株15株，結合不同溫度條件下的生長速度，進一步篩選獲得4 株木霉菌株（MD8、MD30、JS11、LI2C），其在35 和40℃均能生長。其中，在35℃下，菌株MD30、JS11、LI2C 生長48 h 后完全長滿平板，菌落直徑達8.5 cm；而在40℃下，僅菌株MD30 和LI2C 生長48 h 后完全長滿平板，菌落直徑達8.5 cm（圖1）。2.2 室內條件下功能木霉菌株的復篩結果

2.2.1 木霉生物有機肥施用對黃瓜生物量的影響

將可在40℃下生長的菌株MD8、MD30、JS11、LI2C 和NJAU4742 制作成木霉生物有機肥進行盆栽試驗。第1 季盆栽試驗結果表明，4742 和MD30木霉生物有機肥處理黃瓜地上部鮮重和干重均顯著高于不施肥對照（CK）、化肥處理（CF）、有機肥處理（OF）和MD8、JS11、LI2C 木霉生物有機肥處理（圖2A）。MD30 處理的黃瓜鮮重和干重較CK 處理分別增加了29%和64%；與CF 處理相比，分別增加了19%和31%；與OF 處理相比，分別增加了15%和26%。第2 季盆栽試驗結果表明，4742 和MD30 木霉生物有機肥處理對黃瓜苗期的促生效果仍顯著，其中MD30 處理地上部鮮重和干重相比于CK 處理，分別增加了116%和53%；相比于CF 處理，分別增加了28%和22%；相比于OF 處理，分別增加了15%和11%（圖2B）。

2.2.2 木霉生物有機肥施用對黃瓜土壤木霉屬數量的影響

由圖3 可知，兩季盆栽試驗中施用木霉生物有機肥處理能增加土壤中可培養木霉屬的數量，MD30 和4742 木霉生物有機肥處理土壤中木霉屬數量均達到5×104cfu/g 以上，顯著高于其他處理，但MD30 與4742 處理間無顯著差異。

2.3 功能木霉菌株的鑒定

由圖4 可知，菌株MD30 在PDA 平板上生長較快，絨毛狀白色菌絲，大量產生綠色孢子，有白色雜質，形成同心輪紋，新鮮菌株背面產生黃綠色可擴散性色素。

根據ITS 序列構建的系統發育樹（圖5A）分析表明，菌株MD30 屬于肉座菌目肉座菌科木霉屬真菌，根據tef1 序列構建的系統發育樹（圖5B）表明，MD30 位于T.longibrachiatum 分支上，與模式菌株T.longibrachiatum ATCC 18648 相近，進一步結合菌株的形態特征，將MD30 鑒定為T.longibrachiatum 長枝木霉。

2.4 田間條件下木霉生物有機肥對芒果生產的生物學效應

2.4.1 木霉生物有機肥施用對芒果產量的影響

據盆栽試驗效果，選擇菌株MD30 研制成生物有機肥并進行田間試驗。由圖6 可知，MD30 處理的產量顯著高于不施肥處理（CK）、化肥處理（CF）、有機肥處理（OF）和NJAU4742 木霉生物有機肥處理（4742），分別增產13%、7%、6%和3%。MD30 處理的單果重和商品大果重均顯著高于CK、CF、OF 和4742 處理，MD30 處理單果重分別比CK、CF、OF 和4742 處理增加43%、37%、40%和25%；商品大果重分別增加63%、27%、33%和22%。結果表明施用木霉MD30 生物有機肥能提高芒果果重，達到增產的效果。

2.4.2 木霉生物有機肥施用對芒果果實品質的影響

由圖7 可知，MD30 處理顯著提高了芒果果實中可溶性固形物和還原糖的含量，減少了維生素C 含量。與CK、CF、OF 和4742 處理相比，MD30 處 理的可溶性固形物含量分別增加了13%、10%、9%和7%；還原糖含量分別增加了21%、20%、13%和6%。

2.4.3 木霉生物有機肥施用對芒果土壤理化性質的影響

由表3 可知，MD30 處理相比CK、CF、OF 和4742 處理，土壤全磷和有效磷含量存在顯著性差異；MD30 處理的有機質含量、全磷、全鉀、有效磷和速效鉀含量顯著高于CK 處理。各處理中土壤pH 和全氮含量差異不顯著。

表3 不同施肥處理對土壤理化性質的影響

3 結論與討論

木霉生物有機肥能夠有效補充作物生長所需營養元素，促進植物生長，是提高農作物產量和品質的重要途徑［17］。本研究首先從海南芒果根圍土土壤中分離木霉菌株，經過35 和40℃條件下測量菌絲生長直徑初步篩選得到了4 株耐熱木霉菌株，其中菌株MD30 能在35 和40℃下正常生長且48 h 后菌落直徑最大，表明該菌株具有一定的耐熱性。

將篩選出的菌株研制成木霉生物有機肥并通過盆栽試驗復篩，驗證其促生效應。雖然兩季盆栽種植時氣溫有明顯差異，導致兩季生物量差異較大，但兩季盆栽試驗結果均表明，施用MD30 木霉生物有機肥對黃瓜生物量的促進作用最為顯著。楊春林等［18］研究發現，木霉生物有機肥對黃瓜、白菜、辣椒和菠菜等多種蔬菜的生長有較強地促進作用。此外，李瑞霞等［10］研究證明，施用含菌株NJAU4742的生物有機肥能夠有效促進番茄生長，提高肥料利用率。相比于CK、CF 和OF 處理，木霉生物有機肥處理的盆栽土壤木霉菌數量顯著提升。生物有機肥具有活化土壤養分、促進植物生長、環境友好等特性［19-20］，研究表明功能菌有效活菌數是生物有機肥在促進作物生長方面的關鍵因素［21］。因此，推斷是由于生物有機肥中含有大量木霉功能菌，從而促進植物生長。MD30 與4742 處理相比，促生效果沒有顯著性差異，這可能是由于宜興的環境溫度處于木霉生長適應溫度，體現不出菌株MD30 適溫范圍寬的特性。

與鐘川等［22］對芒果研究、鄒榮松等［23］對草莓研究、秦光齊等［24］對馬鈴薯研究結果一致，將MD30 生物有機肥施用于海南芒果大田試驗中，MD30 處理顯著提高了芒果產量，有效改善了果實品質。Molla 等［25］發現施用木霉生物有機肥可以顯著提升番茄果實的可溶性固形物、糖分及其他指標，與本研究結果相似。土壤有機質是土壤肥力水平的主要指標，提高土壤有機質有助于芒果產量的提高。MD30 和4742 處理顯著提高了芒果大田土壤有機質、有效磷和速效鉀的含量，提高了土壤肥力，這可能是木霉菌在生命活動周期中產生大量有機酸，使土壤中速效的氮、磷、鉀等營養得到釋放，供植物生長［26］。趙政等［27］發現減量化肥配施NJAU4742 木霉生物有機肥不僅能保證番茄穩產，還能顯著提升番茄果實品質，活化土壤養分，改變土壤微生物群落結構，從而改善土壤肥力狀況，這與本試驗研究結果一致。MD30 和4742 處理均能提高芒果的產量和品質，但MD30 處理的效果最佳，可能是因為海南地區土溫較高，更適合于適溫范圍寬的菌株MD30 生存及發揮作用。

綜上所述，菌株NJAU4742 和MD30 均有促生效果，但是菌株MD30 更能適應熱區環境條件，促生效果更佳。本試驗分離篩選獲得一株能在40℃高溫生長的促生木霉菌株MD30，經鑒定為長枝木霉菌（T.longibrachiatum），開發出了適用于熱區芒果園的專用生物有機肥，為熱區果樹的減肥減藥提供了技術支持與理論依據。