高效液相色譜法測定肥料中3，4-二甲基吡唑磷酸鹽的方法研究

保萬魁，黃均明，韓巖松，劉 蜜，劉紅芳

（中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

通過在氮肥或其施用過程中添加硝化抑制劑和脲酶抑制劑（統稱為肥料增效劑［1-2］）來降低土壤脲酶、土壤亞硝酸細菌活性，從而減少氮損失，是提高氮肥利用率的重要途徑之一。

3，4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）是國內外研究較多的一種新型硝化抑制劑。DMPP 分子式為C5H8N·H3PO4，灰白色粉狀物質，分子量為194.2，熔點165℃，密度1.51 g/cm3（20℃），水中溶解度為132 g/L，pH 值為2.5～3.0，蒸汽壓小于10-4Pa（20℃）［2］。作為硝化抑制劑，其可以和銨態氮肥及能產生銨態氮的酰胺態氮肥尿素等混合使用。許多試驗表明，DMPP 在提高作物產量、改善品質、提高作物氮肥利用率、減少環境污染方面的作用效果顯著［3-12］。同時，與其它硝化抑制劑相比，DMPP 還具有用量小、抑制效果好、對土壤和作物均沒有毒害的優點，并且在土壤中降解慢，抑制時間較長，遷移性小，不易與土壤剖面中的銨態氮分離［13-14］。因具有上述諸多獨特效果，DMPP 在農業上的應用也日益廣泛［3］。目前已在中國、澳大利亞、比利時、法國、德國、意大利、西班牙和新西蘭等多個國家注冊［2，4，15-16］。

然而，DMPP的作用效果在不同環境條件下存在一定的波動性。其硝化抑制效率的高低、有效作用期的長短及施用效果，均受到用量和施用形式、土壤質地、環境溫度、土壤水分、土壤酶活性、土壤酸堿狀況等多因素的綜合影響［10，17］。因此，有研究者認為DMPP 硝化抑制效果不如氯甲基吡啶［18］，或DMPP 對農產品沒有明顯的增產效果［8］。雖然施用DMPP 顯著減少了溫室氣體N2O 和CO2的排放量，但是增加了氨的揮發［13］。

可以看出，作為硝化抑制劑的DMPP 必須科學、適量使用才能達到預期效果和最佳效益。而準確定量測定是做好此類產品生產、管理和施用的關鍵。近年來，DMPP 在我國的應用越來越多，但國內關于DMPP 測定方法的研究很少，有個別涉及氣相色譜法測定土壤和緩釋尿素中DMPP 含量的報道，采用內標法，操作相對繁瑣［19-20］，而國內關于液相色譜法測定肥料中DMPP 含量的研究未見報道。因此，研究建立肥料中DMPP 含量測定的方法顯得十分必要，研究結果將為此類產品生產控制、質量監督、市場監管，尤其是科學施用等工作提供檢測手段，并在一定程度上為推動肥料產業健康發展提供技術參考。歐盟于2012 年出臺了相關標準“Fertilizers-Determination of 3，4-dimethyl-1H-pyrazole phosphate（DMPP）-Method using high-performance liquid chromatography（HPLC）”（EN 16328：2012），該方法適用于礦質氮肥，且固定的稱樣量（30 g）和較窄的標準曲線范圍等具體操作決定了其主要針對目標物含量相對單一的樣品測定。但根據肥料增效劑和增效氮肥在我國的發展和應用實際，需要面對的樣品不僅僅是礦質氮肥，還包括純DMPP 硝化抑制劑產品、添加DMPP的有機無機復混肥料、有機肥料以及多種原料混合的肥料樣品等，因此，本文在參考上述歐盟方法儀器條件的基礎上，重點就目標物提取、方法線性和穩定性，以及不同原料的可能影響等方面進行研究，力求建立適用于目標物含量變化范圍寬、樣品種類和基體復雜多樣等具體實際的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

除另有說明外，本方法中所用試劑為色譜純，水符合GB/T 6682 中一級水要求。

乙腈；

一水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O），分析純；

3，4-二甲基吡唑磷酸鹽標準品，純度≥99.5%，在-20℃條件下貯存；

3，4-二甲基吡唑磷酸鹽標準溶液：ρ（DMPP）=1000 mg/L。準確稱取0.1 g（精確至0.0001 g）3，4-二甲基吡唑磷酸鹽標準品，置于100 mL 容量瓶中，加入50 mL 水并振蕩至完全溶解后，用水定容。

1.2 儀器和設備

Waters2695 高效液相色譜儀，配紫外檢測器；AS 系列超聲波清洗器；JRA-604C 恒溫振蕩器；BSA224S 型電子天平（精度0.0001 g）；微孔濾膜：0.45 μm，水系。

1.3 供試樣品

樣品包括搜集的肥料和DMPP 產品，以及自制的樣品共若干個。

1.4 分析步驟

1.4.1 試樣的制備

固體樣品縮分至約100 g，將其迅速研磨至全部通過0.50 mm 篩（如樣品潮濕，可通過1.00 mm篩），混合均勻，置于潔凈、干燥的容器中；液體樣品經搖動均勻后，迅速取出約100 mL，置于潔凈、干燥的容器中。

1.4.2 試樣溶液的制備

稱取0.1～3 g（精確至0.0001 g）混合均勻的試樣于250 mL 容量瓶中，加約200 mL 水，塞緊瓶塞，搖動容量瓶使試料分散，置于常溫振蕩器內，在180 r/min 頻率下振蕩后用水定容并搖勻，過微孔濾膜后待測。

1.4.3 儀器條件

——色譜柱：C18，5 μm，150 mm×4.6 mm（長×直徑），或相當者；

——流動相：將1.38 g 一水合磷酸二氫鈉溶于1 L 水中，加入175 mL 乙腈，脫氣；

——流速：1.5 mL/min；

——柱溫：室溫；

——進樣量：10 μL；

——檢測波長：224 nm。

1.4.4 標準曲線的繪制

分別吸取DMPP 標準溶液0.00、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00 mL 于6 個10 mL 容量瓶中，用水定容，搖勻。該標準系列溶液質量濃度分別為0、20、50、100、200、300 mg/L。過微孔濾膜后，按濃度由低到高進樣檢測，以標準系列溶液質量濃度（mg/L）為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.5 試樣溶液的測定

將試樣溶液或經稀釋一定倍數后，在與測定標準系列溶液相同的條件下測定，在標準曲線上查出相應的質量濃度（mg/L）。

2 結果與分析

2.1 不同提取條件對測定結果的影響

在其他分析條件保持一致的條件下，參考相關方法的提取條件［21］，在常溫下分別選擇超聲和180 r/min 頻率下振蕩兩種方式，用不同時間處理樣品，其中D1 由復混肥料樣品添加DMPP 制得，D2 由有機無機復混肥料樣品添加DMPP 制得。所測結果見表1。

表1 不同提取條件對DMPP 測定結果的影響

結果表明，所選兩個樣品在振蕩15 min 條件下測定結果略低，而在其他提取方式、時間的比較之間沒有明顯差別。但因樣品均勻性和代表性需要，實驗人員往往選擇適當增大稱樣量的做法，為保證這種情況下試樣的提取完全，以及從通常實驗室設備條件和實驗提取效率考慮，確定選擇常溫振蕩30 min的前處理條件。以下實驗均按此條件進行樣品前處理。

2.2 線性范圍、回歸方程、檢出限和精密度

在實驗確定的分析條件下，對一系列濃度的3，4-二甲基吡唑磷酸鹽標準溶液進行測定。結果表明，3，4-二甲基吡唑磷酸鹽在0.1～1000 mg/L 范圍內具有良好的線性關系。以3，4-二甲基吡唑磷酸鹽質量濃度x（mg/L）為橫坐標，峰面積y 為縱坐標（圖1），得出回歸方程y=7.21×103x+8.08×103（R2=0.9999）。對空白進行11 次測定，得到標準偏差，以3 倍標準偏差除以標準曲線斜率，求得檢出限，結果為0.004 mg/L。

隨機選取一份樣品，稱取7 份試樣進行平行測定，用以考察實驗方法精密度。7 次平行測定平均值為76.87%，相對標準偏差為0.28%。

2.3 穩定性

用確定的實驗方法，隨機選取不同DMPP 含量的數個樣品，前后間隔30 d 分別進行兩次DMPP含量測定，考察方法穩定性，結果見表2。測定值1 和測定值2 分別為不同時間兩次平行測定結果的算數平均值。結果顯示，用該方法對間隔34 d的樣品重新測定，結果一致性很好，這說明該方法穩定性良好。

表2 DMPP 測定方法穩定性實驗結果 （%）

2.4 不同氮肥原料對測定結果的影響

為驗證與3，4-二甲基吡唑磷酸鹽可配合使用的氮肥原料對其測定結果是否有影響，選擇氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素、尿素硝酸銨溶液以及復混肥料等樣品，用加標法測定回收率，結果見表3。

從表3 看出，供試樣品中DMPP 回收率兩次平行測定結果一致性很好，且兩次測定平均值均在97.9%～101.4%范圍內。另外，實驗過程中通過觀察發現DMPP 色譜圖峰形均很好（圖2，圖3），這說明與DMPP 可配合使用的氯化銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素等氮肥原料及其不同組合（如尿素硝酸銨溶液和復混肥料），以及部分有機物料和NBPT、NPPT 等均不會干擾DMPP的定量測定。更進一步說明，不同氮形態以及氮、磷、鉀的混合均不對DMPP 測定造成干擾。

表3 不同原料對3，4-二甲基吡唑磷酸鹽測定結果的影響 （%）

3 結論

通過樣品前處理條件、方法線性、準確性、穩定性等實驗研究，建立了一種外標法測定DMPP含量的高效液相色譜儀方法。結果顯示這種方法的精密度、準確性等方法性能指標均能滿足檢驗的要求。方法在0.1～1000 mg/L 范圍內線性良好（R2=0.9999），回收率均在97.9%～101.4%之間。同時，該方法具有前處理簡單、分析速度快、干擾因素少、方法穩定且結果準確等特點，適合DMPP產品及不同肥料中DMPP 含量的批量測定。此方法的建立將為我國此類產品生產、流通和使用等環節的管理實踐提供參考技術手段，也將在一定程度上為推動肥料產業健康發展提供基礎支撐。