聚天冬氨酸尿素及生化抑制劑對長江流域典型土壤N2O 排放的影響

劉曼霞，邢志強(qiáng)，張 鑫，付慶靈*，朱 俊，胡紅青，趙洪濤

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北三寧化工股份有限公司，湖北 宜昌 443206）

氧化亞氮（N2O）是一種能在大氣中長時間穩(wěn)定存在的溫室氣體［1］，人類活動每年造成6.7×1012g N2O-N 排放，其中農(nóng)田土壤排放的N2O約占60%（IPCC 2007）［2-3］。氮肥施用是導(dǎo)致農(nóng)田土壤大量排放N2O的重要原因之一，2017 年我國農(nóng)田土壤N2O-N 排放總量約3.2×1010g，其中79.4%是源于氮肥施用［4-5］。

長江流域生態(tài)系統(tǒng)在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有著重要地位，但是該地區(qū)氮肥施用過量造成大量N2O 排放是一個不容忽視的問題。據(jù)調(diào)查顯示，在長江流域農(nóng)民氮肥施用量為N 36～345 kg·hm-2，超出氮肥推薦施肥量20%以上［6］。因此，探討如何減少長江流域不同地區(qū)N2O 排放，提高氮肥利用率，具有十分重要的意義［7］。

氮肥與脲酶抑制劑、硝化抑制劑或二者復(fù)合使用對減少N2O 排放具有較好的作用［8-9］。脲酶抑制劑可以有效減緩尿素的水解，從而抑制尿素向銨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化［10-11］。硝化抑制劑通過抑制硝化和反硝化過程，從而減少N2O 排放［10-11］。在眾多脲酶抑制劑的研究中，N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）被證實(shí)在大田和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中均有顯著抑制脲酶活性的作用［12-15］。3，4-二甲基吡唑磷酸（DMPP）減少N2O 排放的作用效果在許多研究中得到證實(shí)［16］，其在低劑量下就可達(dá)到較好效果［17］，并且經(jīng)檢測無生化毒性［18］。

提高氮肥利用率的另一有效途徑是使用新型尿素替代普通尿素［19-20］。聚天冬氨酸（PASP）是一種可降解的有機(jī)聚合物，可與普通尿素復(fù)配制成新型尿素（PASP 尿素），許多研究證實(shí)，PASP 尿素對植物吸收N、P、K 等營養(yǎng)元素具有一定促進(jìn)作用，并且可以吸附NH4+，有利于尿素緩慢、持續(xù)供應(yīng)養(yǎng)分［21-22］。

但是，關(guān)于PASP 尿素在長江流域不同地區(qū)土壤中的作用效果和DMPP、NBPT 以及二者聯(lián)用對降低長江流域地區(qū)土壤N2O 排放和提高氮的利用率的相關(guān)研究甚少，更無長江流域不同地區(qū)土壤間的對比研究。

本文以長江上游四川紫色土、長江中游湖北黃棕壤性水稻土和長江下游浙江青泥田水稻土為研究對象，通過不同尿素（普通尿素、PASP 尿素）與抑制劑（DMPP、NBPT）聯(lián)合施用，對比研究：1.新型尿素較普通尿素的優(yōu)越性；2.NBPT 和DMPP 對長江流域不同土壤N2O 排放的影響；3.抑制劑與新型尿素聯(lián)用的作用效果。探討長江流域不同地區(qū)供試土壤氮轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)和氮肥減損增效效果，為減少該地區(qū)N2O 排放、指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試土壤

供試土壤分別是：長江上游四川省綿陽縣（105°27′E，31°16′N）紫色土，前茬作物為玉米；長江中游湖北省廣水市（113°53′E，31°16′N）黃棕壤性水稻土，前茬作物為水稻；長江下游浙江省平湖市（121°1′E，30°38′N）青泥田水稻土，前茬作物為水稻。

3 個大田均按5 點(diǎn)取樣法，用鐵鍬采集0～20 cm 耕層土壤，去除石礫和動植物殘體后將所取土壤混合，之后將土壤自然風(fēng)干。四分法取一部分土壤過2 mm 孔徑篩，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫涣硪徊糠滞寥烙糜跍y定理化性質(zhì)［23］，各地區(qū)供試土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)

1.1.2 供試肥料與抑制劑

供試肥料有普通尿素和聚天冬氨酸尿素（PASP 尿素），其中PASP 尿素由湖北三寧化工股份有限公司提供，含氮量為46%，和普通尿素相同。供試抑制劑包括硝化抑制劑3，4-二甲基吡唑磷酸（DMPP，C5H11N2O4P）和脲酶抑制劑N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT，C4H14N3PS），均購自上海源葉生物科技公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

為了探討硝化抑制劑和脲酶抑制劑對供試土壤中尿素轉(zhuǎn)化的影響和添加不同尿素的N2O 排放差異，將采自不同地區(qū)的土壤在相同條件下進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)，每一土壤均設(shè)置8 個處理，每個處理進(jìn)行3 次重復(fù)，其中添加普通尿素的4個處理為：U（普通尿素）、U+D（普通尿素+DMPP）、U+N（普通尿素+NBPT）、U+D+N（普通尿素+DMPP+NBPT）；另外添加PASP 尿素的4 個處理為：P（PASP 尿素）、P+D（PASP 尿素+DMPP）、P+N（PASP 尿素+NBPT）、P+D+N（PASP尿素+DMPP+NBPT）。其中普通尿素和PASP 尿素的添加量均為N 0.1 g·kg-1干土；DMPP 和NBPT用量分別是施入氮的2%和0.2%。

預(yù)培養(yǎng)時，稱取1 kg 土樣（干重）于培養(yǎng)盤中，保持田間最大持水量20%的含水量，于25℃條件下在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d 以復(fù)蘇土壤微生物［1］。在此期間保證良好通氣，每隔1～2 d按稱重法滴加超純水補(bǔ)充流失的水分。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將土壤按照每瓶35 g 干土分別裝至250 mL 培養(yǎng)瓶中，并按照試驗(yàn)設(shè)置添加相應(yīng)的尿素和抑制劑，調(diào)節(jié)水分至田間最大持水量60%，于25℃條件下在人工氣候培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)21 d［1］。

正式培養(yǎng)的第1、3、5、7、10、14 和21 d 用氣密性注射器進(jìn)行首尾兩次取氣，測定其N2O 濃度，并且每次取氣結(jié)束后記錄相應(yīng)時間。完成第二次取氣后，打開培養(yǎng)瓶用稱重法補(bǔ)水，并充分換氣約2 h。同時取大約1.5 g 干土至15 mL 離心管中，用于測定土壤中NO3-、NH4+濃度（每次取土后，按稱重法計算培養(yǎng)瓶內(nèi)實(shí)時土重，以便于后續(xù)N2O 排放計算）。取樣結(jié)束后，蓋上瓶蓋放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

以上采集的氣體樣品使用氣象色譜儀（Agilent GC7890A）分析N2O 濃度。土壤樣品用2 mol·L-1的氯化鉀溶液浸提NO3-、NH4+，使用AA3 連續(xù)流動分析儀測定濃度［24］。

1.3 N2O 釋放速率與累積排放量計算

根據(jù)培養(yǎng)開始后不同時間測定的N2O 濃度，使用Slope 函數(shù)計算N2O 濃度隨時間變化的曲線斜率，選擇R2＞0.9的數(shù)值，按下式計算N2O-N 釋放速率：

式 中：F 為N2O-N 釋放速率（μg·kg-1·h-1）；dc/dt 為培養(yǎng)瓶中N2O 濃度隨時間線性變化的曲線斜率（μL·L-1·h-1）；V 為培養(yǎng)瓶內(nèi)氣體體積（L）；W為干土質(zhì)量（kg）；ρ為標(biāo)準(zhǔn)狀況下N2O 氣體的密度（ρ=1.978 g·L-1）；T 為培養(yǎng)溫度（K）；α為N2O 換算為N的轉(zhuǎn)化因子（28/44）。

按下式計算N2O-N 累積排放量：

式中：C 為N2O-N 累積排放量（μg·kg-1），為兩次取氣間隔時間內(nèi)N2O-N 平均釋放速率（μg·kg-1·h-1），ti為兩次取氣間隔時間（h）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010 匯總計算數(shù)據(jù)、Origin 2018C繪圖、SPSS 25 進(jìn)行方差分析和最小顯著性差異法（LSD）比較不同處理之間N2O 釋放量。

2 結(jié)果與分析

2.1 N2O 釋放速率

四川紫色土不加抑制劑的處理N2O 釋放速率先增加后減小，并在第3 d 達(dá)到最大值，N2O-N 48.30 μg·kg-1·h-1（U）和N2O-N 61.08 μg·kg-1·h-1（P），第7 d 后趨于0（圖1a）。添加抑制劑后N2O釋放速率均有所降低，含有DMPP的處理5 d 后趨于0，添加NBPT的處理7 d 后趨于0。該地區(qū)土壤相同處理?xiàng)l件下，添加PASP 尿素比普通尿素的N2O 釋放速率大。

湖北黃棕壤性水稻土所有處理N2O 釋放速率均呈現(xiàn)下降趨勢。含有DMPP的處理N2O 釋放速率5 d 后趨于0。不添加抑制劑的處理和僅添加NBPT的處理N2O 釋放速率7 d 后趨于0。相同抑制劑處理下，施用PASP 尿素土壤N2O 釋放速率整體上低于施用普通尿素（圖1b）。

浙江青泥田水稻土不加抑制劑的處理，N2O釋放速率先增加后減小，并在第3 d 達(dá)到最大值，N2O-N 10.28 μg·kg-1·h-1（U）和N2O-N 8.60 μg·kg-1·h-1（P），第14 d 后趨于0，并且施用PASP 尿素的處理N2O 釋放速率均低于施用普通尿素的處理對應(yīng)的N2O 釋放速率。僅添加NBPT的處理N2O 釋放速率先減小再增加，在第7 d 達(dá)到最大值N2O-N 5.39 μg·kg-1·h-1（U+N）和N2O-N 6.08 μg·kg-1·h-1（P+N）后又減小，14 d 后趨于0。含有DMPP的處理N2O 釋放速率接近0（圖1c）。

2.2 N2O 累積排放量

四川紫色土含有DMPP的處理，N2O 排放總量降低了70%～86%，其中僅添加DMPP 效果更佳，可降低80%～86% N2O 排放。僅添加NBPT的處理N2O 排放總量比不添加抑制劑的處理降低14%～22%（圖2a）。

湖北黃棕壤性水稻土僅添加NBPT的處理N2O 排放總量比不添加抑制劑的處理高出4%～46%。含有DMPP的處理，N2O 排放總量降低了7%～53%，其中組合抑制劑效果更佳，降低幅度達(dá)30%～53%（圖2b）。

浙江青泥田水稻土僅添加NBPT的處理，N2O 排放總量比不添加抑制劑的處理降低了26%～60%。含有DMPP的處理，N2O 排放總量降低96%以上，單加DMPP 抑制效果更強(qiáng)，幾乎無N2O 排放（圖2c）。

在3 個地區(qū)土壤中均表現(xiàn)出：抑制劑對降低施用普通尿素的處理N2O 排放具有更好的效果，相同處理下，抑制劑對普通尿素N2O 排放的減少量多于PASP 尿素。在湖北黃棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土中，在不使用抑制劑的情況下，施用PASP尿素其N2O 排放總量比施用普通尿素低40%。

總體上N2O 排放總量表現(xiàn)為湖北黃棕壤性水稻土＞四川紫色土＞浙江青泥田水稻土。

長江流域3 個典型土壤N2O 排放總量的分析（表2）顯示，施用不同肥料土壤N2O 排放總量具有顯著差異，使用不同抑制劑對土壤N2O 排放總量的影響也具有顯著差異，不同土壤經(jīng)相同處理其N2O 排放總量也具有顯著差異。交互分析結(jié)果顯示，不同處理和不同土壤對N2O 排放總量的交互作用也具有顯著差異。

表2 長江流域不同典型土壤N2O 排放總量（N2O-N μg·kg-1）

2.3 土壤中銨態(tài)氮含量

四川紫色土所有處理隨著培養(yǎng)時間增長，土壤中NH4+-N 含量逐漸增加。湖北黃棕壤性水稻土所有處理隨著培養(yǎng)時間增長，土壤中NH4+-N 濃度總體呈下降的趨勢。浙江青泥田水稻土所有處理隨著培養(yǎng)時間增長，土壤中NH4+-N 含量先增加后減小，培養(yǎng)結(jié)束時降到初始值以下（圖3）。

四川和湖北供試土壤含DMPP的處理中NH4+-N 含量較高，在第5～7 d 富集最多，土壤中NH4+-N 濃度可達(dá)90～120 mg·kg-1。含NBPT的處理土壤中NH4+-N 濃度比不添加抑制劑的處理低。浙江供試土壤含DMPP的處理土壤中NH4+-N含量較高，含NBPT的處理培養(yǎng)3～10 d 后，土壤中NH4+-N 濃度比不添加抑制劑的處理要高10%～50%。

四川紫色土和浙江青泥田水稻土在相同處理下，施用PASP 尿素土壤NH4+-N 含量略高于施用普通尿素土壤NH4+-N 含量（除浙江青泥田水稻土僅添加NBPT的處理）。湖北黃棕壤性水稻土NH4+-N 含量均較低，施用普通尿素和PASP 尿素土壤NH4+-N 含量相當(dāng)。總體而言，土壤中NH4+-N 含量表現(xiàn)為四川紫色土＞浙江青泥田水稻土＞湖北黃棕壤性水稻土。

2.4 土壤中硝態(tài)氮含量

總體上土壤中NO3--N 含量表現(xiàn)為：四川紫色土＞浙江青泥田水稻土＞湖北黃棕壤性水稻土，3 個供試土壤不含DMPP的處理NO3--N 含量較高（圖4）。

四川紫色土不含DMPP的處理NO3--N 含量隨著培養(yǎng)時間增長緩慢升高，含有DMPP的處理NO3--N含量隨著培養(yǎng)時間增長升高較快。在培養(yǎng)結(jié)束時所有處理中NO3--N 含量逐漸接近，所有處理的NO3--N濃度值均在160 mg·kg-1附近（圖4a）。

湖北黃棕壤性水稻土不含DMPP的處理NO3--N含量隨著培養(yǎng)時間增長先升高后降低，在第7 d 達(dá)到最高濃度10～13 mg·kg-1，但培養(yǎng)結(jié)束時NO3--N 濃度仍高于起始值。含有DMPP的處理NO3--N 含量隨著培養(yǎng)時間增長緩慢升高并保持上升趨勢（圖4b）。

浙江青泥田水稻土所有處理NO3--N 含量均隨著培養(yǎng)時間增長而升高，培養(yǎng)結(jié)束時的濃度是起始濃度1.2～3.2 倍（圖4c）。

3 個供試土壤在不添加抑制劑的情況下，施用PASP 尿素土壤NO3--N 含量總體上高于施用普通尿素的處理，其中湖北黃棕壤性水稻土NO3--N 含量高出部分達(dá)20%～50%。添加抑制劑后，四川紫色土施用PASP 尿素的處理其NO3--N 含量也略高于普通尿素，但湖北黃棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土中NO3--N 含量差異不穩(wěn)定。

3 討論

DMPP 對降低長江流域3 個地區(qū)供試土壤N2O排放具有較好的效果，同時降低了土壤中NO3-含量。與之相反，3 個供試土壤中添加DMPP 后NH4+含量比其他處理高。有研究表明，硝化抑制劑的使用會抑制亞硝化細(xì)菌的生長，降低氨單加氧酶活性［25-26］，從而抑制氨氧化過程中NH4+向NO2-的轉(zhuǎn)化，但是不影響后續(xù)反應(yīng)過程［27］。就本試驗(yàn)而言，使用DMPP 后有效抑制NH4+向NO2-的轉(zhuǎn)化，使得NH4+在土壤中積累，并減少了NO2-向NO3-和N2O的轉(zhuǎn)化。

在四川紫色土和浙江青泥田水稻土中，添加NBPT 對抑制N2O 排放也具有一定的作用。但是在湖北黃棕壤性水稻土中，添加NBPT的處理N2O 排放量反而增加了，這可能是因?yàn)樵摰赝寥榔嵝裕鳱BPT 在酸性土壤中更容易降解，在非酸性土壤中才能較好發(fā)揮抑制尿素水解的作用［28-29］。另外，土壤中脲酶主要由植物、微生物分泌，土壤有機(jī)質(zhì)含量增高會促進(jìn)微生物活性［10］，湖北黃棕壤性水稻土有機(jī)質(zhì)含量較高，有利于微生物分泌脲酶，故NBPT的抑制效果不佳。

四川和浙江地區(qū)供試土壤僅添加DMPP 抑制N2O 排放效果最佳，而湖北黃棕壤性水稻土中，DMPP 和NBPT 配施效果最好。這可能是因?yàn)椋蛩厮鉃镹H4+釋放一分子OH-，但是NH4+氧化成NO3-釋放兩分子H+，從而使土壤酸化，而硝化抑制劑減弱了氨氧化作用，可以延緩?fù)寥浪峄雇寥纏H 值升高［30-31］，從而更適合NBPT 發(fā)揮作用，二者聯(lián)用加強(qiáng)對N2O 排放的抑制效果。由前人的研究得知，DMPP 會通過影響氨氧化微生物的豐度來影響土壤N2O的排放［32］，并且土壤中Cu2+含量也會影響氨氧化酶的活性［33］。因此，兩種抑制劑在不同土壤中的作用效果差異可能由土壤性質(zhì)、微生物作用等因素不同所致，后期可深入研究不同處理下、不同土壤中微生物的功能差異，從而深入分析土壤氮轉(zhuǎn)化機(jī)理。

3 個供試土壤施用PASP 尿素后，土壤N2O釋放速率相較于施用普通尿素有所降低，印證了PASP 尿素具有緩慢降解的效果［20-22］。在不使用抑制劑的情況下，湖北黃棕壤性水稻土和浙江青泥田水稻土施用PASP 尿素的處理相較于施用普通尿素，其土壤N2O 排放總量顯著降低，但與抑制劑聯(lián)用后效果不明顯。施用PASP 尿素的土壤中NH4+-N、NO3--N 含量均高于施用普通尿素，提高了氮肥潛在的有效性［34］。結(jié)合PASP的分子特性分析，PASP 尿素發(fā)揮作用主要是由于可以固持NH4+，可能對減少氨揮發(fā)造成的氮損失具有較好的作用。而氨揮發(fā)受溫度、水分、通氣條件等因素影響較大［35］，而本試驗(yàn)在培養(yǎng)過程中保持相同的溫度和持水量，未測定土壤氨揮發(fā)指標(biāo)，因此要合理評估PASP 尿素的減損效果還需進(jìn)一步研究其施用對氨揮發(fā)的影響。

本研究主要通過測定N2O 和土壤中不同形態(tài)的氮來分析添加的抑制劑對長江流域不同土壤和不同種類肥料的作用效果以及施用普通尿素和PASP 尿素土壤氮轉(zhuǎn)化的差異，但是具體分子調(diào)控機(jī)制尚不明確，后續(xù)可結(jié)合不同培養(yǎng)體系中微生物的響應(yīng)進(jìn)一步探討氮素轉(zhuǎn)化機(jī)理和抑制劑作用效果。

4 結(jié)論

綜合以上結(jié)果，本研究初步得出以下結(jié)論：（1）使用PASP 尿素替代普通尿素對于減少土壤N2O 排放有一定效果。（2）硝化抑制劑DMPP 有效抑制了長江流域不同地區(qū)土壤中氨氧化過程；減少了N2O 排放，緩解了溫室氣體造成的危害；減少了土壤中NO3-含量，降低了淋溶造成氮損失的風(fēng)險。（3）脲酶抑制劑NBPT 在四川、浙江堿性土壤中對減少N2O 排放也具有一定作用。