CRISPR基因編輯技術及其在眼科疾病中的應用進展

馬丹寶，鐘瑋曄 綜述 于晨 審校

(1.深圳灣實驗室腫瘤研究所，廣東 深圳 518132；2.斯特拉斯堡大學生命科學學院，法國 斯特拉斯堡)

基因編輯是通過導入、修改、沉默特定基因，以研究基因功能，構建疾病模型，以及治療特定疾病的一種新興技術[1]。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術的發明，大大提高了基因編輯的靈活性，并加快了基因編輯技術從實驗室走向臨床治療的步伐[2]。眼球獨特的生理結構，使眼科疾病在基因編輯療法的應用上具有先天的優勢。眼球體積較小，需要的治療載體較少。眼部區域具有免疫赦免，這既可避免外源性物質引起的炎癥和免疫反應，也有利于基因編輯載體維持其活性。同時，慢病毒和AAV等載體介導的眼科疾病基因療法，不會引起全身性反應[3]。另外，多種嚴重眼科疾病與基因突變密切相關。這些特點使眼科疾病的治療對基因編輯療法有著強烈的需求，為其在眼科疾病治療中的率先應用創造了條件。本文將從CRISPR/Cas9(Cas9，CRISPR associated protein 9，曾使用Cas5、Csn1、Csx12等名稱)基因編輯技術的發展、基因編輯療法在眼科疾病治療中應用的現狀、以及CRISPR基因編輯技術的最新發展等幾個方面，介紹CRISPR基因編輯技術及其在眼科疾病治療中應用的前沿進展。基因療法的載體及遞送策略，相關綜述文獻已有闡述[4]，在此將不再贅述。

1 第1代CRISPR-Cas9基因編輯技術

CRISPR系統是一種原核生物獲得性免疫系統[5-6]。它由一系列CRISPR相關蛋白、可編程RNA分子和Cas9核酸內切酶所組成。當外源病原體侵入細菌后，該系統將外源DNA片段整合到細菌基因組中，并以該片段為模板轉錄加工出CRISPR RNA(crRNA)[7]。病原體再次感染細胞時，該crRNA介導Cas9蛋白靶向切割病原體DNA，從而達到消除病原體，保護細胞的作用。

2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpenier將CRISPR/Cas9系統改造，實現了由引導RNA(guide RNA)介導的DNA靶向切割[2]。該系統由Cas9核酸內切酶和單鏈引導RNA(single-stranded guide RNA，sgRNA)所組成(圖1)。SgRNA引導Cas9特異結合與sgRNA上一段RNA序列互補的DNA序列，隨后在附近將DNA雙鏈切割。被切割后的DNA形成雙鏈斷裂(double strand break，DSBs)，DSBs會激活內源性DNA損傷修復機制[8]。例如非同源性末端接合(nonhomologous end-joining，NHEJ)在將DSBs重新連接的過程中，會產生插入或刪除突變(indel)，而indel突變往往造成編碼位移(frameshift)以及基因敲除[9-10]。如用多個sgRNA介導多處DSBs的形成，則會促進DSBs之間大片段的染色質重排(genomic rearrangement)，如染色體內易位(intrachromosomal translocation)和染色體內倒位(intrachromosomal inversions)[11-13]。這些機制均可實現高效的基因敲除。

圖1 第1代CRISPR/Cas9基因編輯技術Figure 1 The first generation of CRISPR/Cas9 gene editing technology

除NHEJ機制外，CRISPR/Cas9切割導致的DSBs還可誘導另一種DNA損傷修復機制——同源重組修復(homology-directed repair，HDR)[14]。在單鏈DNA分子或雙鏈質粒DNA模板存在的情況下，HDR可精確引入模板序列，從而導致基因突變、基因修正、基因插入[15]。

2 CRISPR-Cas9基因編輯療法治療眼科疾病的最新進展

2.1 Leber先天性黑矇(已在患者中開展I期臨床試驗)

一部分10型Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis 10，LCA10)是由CEP290基因的功能缺失性突變所導致[16]，絕大多數患者出生后視力低下或完全失明。在高加索人種中，最常見的LCA10是由CEP290基因上的IVS26突變所導致[17-18]。該突變位于26號內含子，突變創造了一個新的剪接位點，導致mRNA被錯誤剪接及蛋白翻譯的提前終止[19]。同時，由于CEP290基因較大(7.5 kb)，受載體容量限制，傳統依賴于AAV載體引入全長基因的方法無法對其實現修復。CRISPR基因編輯治療旗艦公司Editas開發了一款使用CRISPR-Cas9的基因編輯產品EDIT-101(AGN-151587)[20]，該產品在IVS26突變兩側切割DNA，造成IVS26突變的刪除，從而誘導正常的mRNA剪接，并恢復CEP290功能。目前美國食藥監局FDA已經批準該療法的臨床試驗，2020年，一位先天失明患者成為該療法的第1位臨床試驗患者，另外17位成人及兒童患者隨后將接受EDIT-101單眼的視網膜下注射[21]。

2.2 2A型Usher 綜合征(已完成動物上的臨床前研究，即將開展I期臨床試驗)

2A型Usher綜合征(Usher syndrome 2A)，由USH2A基因上的突變所導致[22]，其特征為聽力損傷和由視網膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)引起的進行性視力喪失。USH2A基因編碼一個位于感光細胞連接鞭毛(connecting cilium)處的跨膜基質蛋白，該蛋白被認為對于穩定感光細胞連接處外側結構具有重要作用[23]。該基因13號外顯子上c.2299delG突變導致編碼位移及蛋白產物缺損，引起鞭毛缺陷。Editas公司的基因編輯產品EDIT-102利用Cas9在13號外顯子兩側進行切割，引起13號外顯子的敲除[24]。缺失13號外顯子的USH2A基因可產生功能正常的蛋白。該策略已在小鼠中被證明有效，目前正在準備開展臨床試驗。

2.3 單純皰疹病毒性角膜炎(已完成動物上的臨床前研究，即將開展I期臨床試驗)

單純皰疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)是單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)引起的一種嚴重感染性角膜疾病[25]。其中，復發性HSV感染是感染性角膜失明的主要原因。復發性HSK由潛伏于三叉神經節處的HSV復發，并隨后引起基質的炎癥反應所導致[26]。CRISPR/Cas9系統可以特異性在病毒基因組導入突變，是一種新型的抗病毒策略。為尋找抗病毒的最佳靶點，Editas的研究人員[27]對HSV基因組進行了篩選，他們發現UL48和RL2是兩個最為有效的靶點。對這兩個靶點的突變高效抑制HSV的復制。動物實驗[27]表明：靶向突變UL48和RL2可以減少91%的角膜損傷，以及淚膜中75%的病毒載量。這種基于CRISPR/Cas9的抗病毒策略有望成為對抗復發性HSV感染的新一代治療方法。

2.4 視網膜色素變性(正在動物上進行臨床前研究)

視網膜色素變性是一類以進行性感光細胞和色素上皮細胞功能障礙為特征的遺傳性疾病，是世界范圍內常見的致盲性眼病[28]。RP在人群中發病率約為1/3 000～1/7 000，RP可通過常染色體顯形、隱形或X染色體關聯方式遺傳。RP的發病機制尚不完全明確，目前已有幾十個基因的突變被認為與RP高度相關，目前的研究熱點包括RHO、PRPF31、RP1、PRPH2、IMPDH1、NR2E3、SNRPN200、CRX等基因[29]。針對這些基因突變，科學家已經開始設計相關的基因編輯治療策略。例如，RHO基因編碼1個感光細胞蛋白Rhodopsin，在視覺信號轉導中有重要作用[30]。RHO一個基因拷貝上的P23H突變，導致Rhodopsin蛋白的錯誤折疊和蛋白降解途徑的過載，引起了野生型RHO拷貝蛋白產物的降解[31]。Giannelli等[32]的研究表明：在小鼠模型中，通過CRISPR/Cas9系統靶向P23H突變的RHO基因拷貝，可以特異性敲除該基因拷貝，減緩Rhodopsin的降解并促進視力的恢復。

3 新一代CRISPR基因編輯技

第1代CRISPR-Cas9基因編輯技術，如依賴于HDR或NHEJ的基因編輯，均以Cas9等CRISPR相關核酸酶對DNA的靶向切割，以及隨后產生的DSBs為前提。雖然這一途徑極大加速了基因編輯的過程，但隨著DSBs的修復，NHEJ通路介導的indel突變難以避免[33-34]。這一根本性缺陷，有可能影響基因編輯療法的安全性及治療效果。另外，HDR介導的精確基因編輯，只發生在G2和S期[35-36]，理論上只可應用于增殖活躍的細胞，很難被應用于眼科疾病中。為解決上述限制，科學界正積極開發新一代CRISPR基因編輯系統，包括單堿基編輯(base editors)，反轉率相關CRISPR編輯(prime editors)和轉座子相關CRISPR編輯(transposon-associated CRISPR)等。這些新的系統，均有望被開發為新一代基因編輯療法，應用于眼科疾病。

3.1 單堿基編輯

單堿基編輯是一種不經DSBs介導而引入點突變的技術，以保留Cas9蛋白單鏈切割能力的nCas9為基礎，融合腺核苷去氨酶(Adenosine deaminase)，介導靶向的去氨基反應[37-38]。目前已有多種單堿基編輯系統面世，包括CBEs(介導C到T編輯)[37-38]、ABEs(介導A到G編輯)[39]、GBEs(glycosylase base editors，介導C到G編輯)[40]等。單堿基編輯器(以CBEs為例)首先對靶向DNA單鏈進行切割，隨后系統中的去氨酶融合到切割部位，催化去氨基反應。去氨基反應將C轉變為U，導致U-G錯配。U-G錯配隨后會被內源DNA修復機制修改為T-A，完成C-T編輯。其他單堿基編輯系統，根據融合酶的不同，作用機制有所不同。但總體來說，單堿基編輯既不依賴于細胞周期[41]，也不引入DSBs，有望被廣泛應用于眼科多種疾病的治療。

3.2 反轉錄相關CRISPR編輯

與單堿基編輯相似，反轉錄相關CRISPR編輯系統仍然采用nCas9[42]。不同的是，反轉錄相關CRISPR編輯利用反轉錄酶結構域與nCas9融合。同時，反轉錄相關CRISPR編輯采用pegRNA(prime editing guide RNA)代替sgRNA，其上除了含有靶向DNA的引導RNA序列外，還含有反轉錄編輯的模板。基因編輯時，nCas9首先對靶向區域單鏈進行切割，隨后切割開的3’端DNA與位于pegRNA上的互補序列結合，并在反轉錄酶結構域的作用下，以pegRNA為模板合成互補DNA序列。隨后，這一新合成的DNA序列被細胞內源DNA修復機制整合入雙鏈DNA中，完成基因編輯。相比單堿基編輯，反轉錄相關CRISPR編輯可以引入任意的DNA突變，具有更大的靈活性。但同時，這一系統有一定的概率引入indel突變副產物。盡管如此，反轉錄相關CRISPR編輯由于具有較自由的插入和刪除特定基因片段的能力，仍被認為具有巨大的臨床應用前景。

3.3 轉座子相關CRISPR系統

除上述系統外，還有2個研究小組[43-44]獨立開發了轉座子相關的CRISPR系統。以Strecker等[43]開發的CAST系統為例，該系統由3個部分組成：CRISPR/Cas12k靶向系統，TnsB-TnsC-TniQ轉座子系統，包含兩側轉座子序列的DNA模板。該系統進行基因編輯時，Cas12k靶向特異DNA序列，TnsB和TnsC將模板序列切割加工，TniQ將加工后的模板插入靶細胞基因組DNA中，完成基因編輯。這類轉座子相關的CRISPR基因編輯系統完全獨立于靶細胞內源DNA損傷修復機制，理論上可大大提高基因編輯的效率、提高可插入片段的長度，適合大片段的基因插入和敲除等操作。但與此同時，轉座子末端序列會整合入受體細胞基因組，這使得基因編輯不可避免地引入了額外的序列。同時該類系統目前還未應用于真核細胞。盡管如此，類似的工具被改造并適用于真核細胞后，也可成為眼科疾病基因編輯療法的有力工具。

4 結語

基于CRISPR的基因編輯療法，是一種從根本上改變疾病治療方案的技術。目前該療法仍存在遞送效率低、存在脫靶效應等缺陷。但總體來看，通過CRISPR基因編輯實現眼科疾病的治療，具有很大的潛力，為多種眼科疾病、特別是罕見病的治療帶來了曙光。以單堿基編輯為代表的新一代CRISPR基因編輯工具，未來有望被開發為安全性更高、治療效果更好的眼科疾病基因療法。例如一些由基因點突變引起的眼科疾病，如PRPH2基因上多種點突變引起的視網膜色素變性[45-46]、LCAT基因上IVS4點突變引起的魚眼病(fish-eye disease)[47]等，可采用單堿基編輯器加以修復。隨著Editas公司LCA10臨床試驗的展開，以及多種眼科疾病的治療方案完成臨床前實驗，CRISPR基因編輯對眼科疾病治療的研究也即將進入爆發階段。在不久的將來，人類必然可以通過改變患者的基因組實現對多種眼科疾病的治療。